Введение Для понимания физиологического состояния организма в практике широко используются показатели, связанные с важнейшей тканью организма

4 Введение Для понимания физиологического состояния организма в практике широко используются показатели, связанные с важнейшей тканью организма позвоночных кровью. Главнейшая функция крови поддержание гомеостаза - единственно возможного способа существования живого организма, являющегося открытой системой и находящегося в постоянном контакте с окружающей средой (Гильмутдинов, Курбанов, 1999). Правильное представление о кроветворении, составе и свойствах крови помогает достаточно точно распознавать нормальные и патологические процессы в организме (Васильев, 2005; Соколина и др., 1997). Значительное внимание при диагностике различных состояний уделяется форменным элементам крови. Последние обычно рассматриваются в свете их защитных и иммунологических функций и гемостатических свойств. Изучение параметров крови особенно актуально для своевременного выявления патологических процессов при проведении мероприятий по сохранению и искусственному разведению редких и исчезающих видов рептилий (Eliman, 1997; Martinez-Silvestre and al., 2005; Metin and al., 2006; Trojano and al., 1997, 1999; Whiting and al., 2007; Work and al., 2000). В условиях научно-технического прогресса принципиально важной задачей становится оценка качества среды. При использовании биоиндикации, одной из тест-систем может служить кровь, отражающая общее состояние организма и чувствительная к действию неблагоприятных факторов окружающей среды (Дробот, Жгулева, 2005; Павлов, 1998; Тарасенко, 1989; Burger and al., 2005). 4

5 Характеристика форменных элементов рептилий В каждом классе позвоночных и в таксонах более низкого ранга функциональные и морфологические характеристики отдельных элементов крови и состояния гомеостаза в целом имеют существенные различия. В этом отношении, пресмыкающиеся как этап эволюции позвоночных, впервые получивших возможность автономно существовать в наземно-воздушной среде с особыми механизмами кроветворения и иммунной защитой, представляют особый интерес (Ганщук и др., 2005; Canfield, 1998). Этот класс амниот, являясь предками млекопитающих и птиц, имеет уровень организации, позволяющий лучше понять биологию кроветворения и иммунный статус высших позвоночных. Кроме того, морфологические признаки клеток крови могут выступать в качестве одного из систематических признаков внутри самого класса, ввиду большого разнообразия их черт у разных отрядов и родов рептилий (Хамидов и др., 1978; Хамидов и др., 1979; Соколина и др., 1997; Васильев, 2005; Azevedo and al., 2003; Canfield, 1998; Martinez-Silvestre and al., 2005; Montali, 1988). В настоящее время среди выдвинутых за время существования гематологии, как науки, моделей кроветворения современными данными подтверждена унитарная теория, разработанная отечественным ученым А.А Максимовым (Maximov, 1909). Еще в начале прошлого века он писал о роли лимфоцита как родоначальной клетки. Противоречия в вопросе происхождения клеток крови в настоящее время разрешены работами на физиологической и культуральной основе. Имеется множество данных, свидетельствующих о наличии единой родоначальной клетки для всех ростков крови, способной к самоподдерживанию и дифференцировке. Она относится к классу полипотентных клеток и первоначально дифференцируется в двух основных направлениях, образуя клетки родоначальницы миелопоэза и лимфопоэза. 5

6 Несмотря на то, что данная модель разработана для млекопитающих, основные её положения являются верными и используются при изучении кроветворения рептилий и у других классов позвоночных. Механизмы кроветворения, индуцирующие процесс миелопоэза, приводят к образованию из стволовой клетки гемоцитобласта и клетки предшественницы лимфопоэза (рис. 1). Гемоцитобласт дает начало эритроцитарному, гранулоцитарному, моноцитарному и тромбоцитарному рядам. А клетка-предшественница лимфопоэза дает начало лимфоцитам и плазматическим клеткам. Среди рептилий имеются значительные различия в морфологии циркулирующих клеток и физиологических нормах гематологических показателей. У некоторых видов ящериц, например, у игуан и варанов кровь имеет гетерофильный профиль, хотя для Iguana iguana отмечено преобладание лимфоцитов в крови (Aguna, 1975). Для ряда видов ящериц (Mayer and al., 2005), и некоторых видов змей (Trojano and al., 1997) характерен лимфоцитарный профиль крови. У некоторых пресноводных черепах доминируют базофилы (Васильев, 2005), в то время как у некоторых видов змей (Trojano and al., 1999) и кайманов (Mussart and al., 2006) они крайне малочисленны (табл. 1) Основную массу элементов крови составляют эритроциты. Они у рептилий, как и у птиц и амфибий овальной формы и содержат ядро, в отличие от эритроцитов млекопитающих, однако имеют меньшую поверхность (примерно в 1,63 раза), что говорит об их меньшей функциональности. Имеются данные о том, что гемоглобин эритроцитов рептилий, например, аллигаторов, обладает большей окисляемостью, что позволяет лучше усваивать кислород (Agar and al., 1977). Для эритроцитов рептилий характерна максимальная продолжительность жизни среди позвоночных. У черепах она достигает 11 месяцев (Гильмутдинов, Курбанов, 1999). 6

7 Схема кроветворения рептилий Рис. 1. Cоставлен на основе обобщенной схемы кроветворения позвоночных животных (Хамидов и др., 1986). 7

8 Таблица 1 Соотношение клеток белой крови у разных систематических групп и видов рептилий. Вид Балканская черепаха - Testudo marginata (Lopez-Olvera and al., 2003) Зеленая игуана - Iguana iguana (Aguna, 1975) Бородатая агама - Pogona vitticeps (Eliman, 1997) Обыкновенный хамелеон - Chameleo chameleon (Cuadrado and al., 2002) Курносая копьеголовая змея - Bothrops ammodytoides (Trojano and al., 1999) Каскавелла - Crotalus durissus terrificus (Trojano and al., 1997) Кайман широкомордый - Caiman latirostris. (Mussart an al., 2006) Кайман жакаре - Caiman crocodilys yacare. (Mussart an al., 2006) Лейкоцитарная формула (%) Гетерофилы Эозинофилы Базофилы Азурофилы Моноциты Лимфоциты 33,3 (12-54) 16,4 8,7 (0-21) 17,1 (4,6-40) - - 2,9 (0,8-10,2) - 0,7 (0-2) 17,5 (7,1-31,7) 55 (21-80) 44,6 (21,6-62,5) (55-72) 0 0,5 (0-2) - 9 (5-18) 25 (22-31) 12,2 16,3 1 9,8 8,2 52, ,5 18,05 5,2 56,25 16,3 2,3 0,5-5,2 77,2 18,4 2,1 0,2-4,8 71,8 8

9 Морфологически эритроциты схожи у всех групп рептилий (Knotkova and al., 2002). Рептилии обладают довольно крупными эритроцитами, по сравнению с птицами и млекопитающими (Canfield, 1998). Для ящериц характерны наиболее мелкие среди всех рептилий размеры эритроцитов. Например, у ящериц размеры эритроцитов в среднем составляют х 8 10 мкм, у черепах около 20 х 11 мкм (Васильев, 2005). Более мелкие эритроциты имеют в целом большую площадь поверхности по отношению к объему клетки, что оказывается важным при связывании кислорода и выделении оксида углерода, т.е. способствуют большему насыщению крови кислородом (Sevinc and al., 2000). Наиболее крупные эритроциты среди рептилий характерны для гаттерии Sphenodon punctatus, для черепах и крокодилов (Sevinc and al., 2000; Metin and al., 2006; Ugurtas and al., 2003). Эритроциты водных черепах крупнее, чем эритроциты сухопутных видов (Ugurtas and al., 2003). У зеленых игуан отмечены межполовые различия в размерах эритроцитов - у самок они крупнее, чем у самцов (Aguna, 1975). У прыткой ящерицы наблюдается обратная картина (Дробот, Жгулева, 2005), в то время как у Lacerta rudis вообще не отмечены различия между размерами эритроцитов самцов и самок (Sevinc and al., 2000). Для ящериц характерно наибольшее количество эритроцитов у большинства видов до 1 млн/мкл, иногда до 2 млн (Васильев, 2005). Ядра эритроцитов рептилий, в отличие от эритроцитов птиц, являются функционирующими. Ядро часто повторяет форму клетки. Хроматин расположен на сине-голубом фоне (при окраске по Романовскому-Гимзе) в виде лежащих близко друг к другу мелких глыбок. Значительная доля эритроцитов рептилий имеет множество выростов и инвагинаций ядра, иногда последние распадаются на сегменты. Также в цитоплазме эритроцитов отмечаются различного рода включения в виде гранул, происхождение которых обсуждается (Davis and al., 2008). 9

10 В крови змей встречаются клетки, относящиеся к эритроидному ряду и носящие название «випроциты» (Большакова, Бакиев, 2005; Соколина и др., 1997; Гильмутдинов, Курбанов, 1999; Павлов, 1998). Они имеют форму расширенного в поперечном сечении эллипса или почти правильного круга. От круглого ядра, окруженного перинуклеарным кольцом с двумя мембранами, отходят 1 13 канальцев, отчего клетка напоминает колесо со спицами. Предполагают определенную роль випроцитов в ядообразовании, так как по одним данным, в крови ядовитых видов они встречаются в раз чаще (Соколина и др., 1997; Гильмутдинов, Курбанов, 1999). По другим источникам наибольшее количество таких клеток было обнаружено у обыкновенного и водяного ужей (1 10 в поле зрения), в то время как у гадюк от 0 до 4. Клетки этого типа были обнаружены в крови и других рептилий: у прыткой ящерицы и разноцветной ящурки Eremias arguta, и у болотной черепахи Emys orbicularis (Большакова, Бакиев, 2005). Тромбоциты рептилий, как и эритроциты, содержат ядра. Они имеют овальную форму и напоминают таковые амфибий и птиц. Цитоплазма клеток прозрачна, слабо базофильна. Тромбоциты обладают способностью к фагоцитозу. Классификация лейкоцитов рептилий во многом несовершенна, поскольку клетки этой группы обнаруживают большую вариабельность в пределах класса. Кроме того, используется различная номенклатура для описания этих клеток. Многие из них напоминают таковые млекопитающих и птиц, поэтому при описании их используются названия, применяемые для лейкоцитов указанных классов позвоночных (Васильев, 2005; Alberio and al., 2005; Canfield, 1998; Knotkova and al., 2002). Мононуклеары рептилий моноциты и лимфоциты, похожи на таковые остальных позвоночных. У чешуйчатых имеется также уникальный тип лейкоцитов азурофилы. Это круглые клетки с единственным ядром и нежными азурофильными гранулами. Они несут в себе морфологические черты 10

11 моноцита и гранулоцита. Отмечены азурофилы и у крокодилов (Sakulvira and al., 2004), в то время как у черепах они очень редки (Martinez-Silvestre and al., 2005). Возможно, что у различных представителей класса рептилий существуют разные по происхождению клетки этого типа, выполняющие сходные функции и имеющие схожие признаки. Количество азурофилов в крови рептилий может варьировать, например, у Elaphe obsoleta (Bounous and al., 1996), у некоторых гремучих змей и ложноногих (Trojano and al., 1997) они являются преобладающими среди лейкоцитов. У ящериц их немного, повышенное же количество этих клеток может указывать на инфекцию (Jaensch and Raidal, 2006), в том числе на зараженность кровепаразитами (Martinez-Silvestre and al., 2005). У ящериц азурофилы в своей средней фазе развития внешне напоминают нейтрофилы млекопитающих или другие типы гранулоцитов. Это вызывает путаницу, так как некоторые авторы называют этот тип клеток «нейтрофилами», что совершенно неправильно, поскольку азурофилы происходят из моноцитарного ствола, а не из гранулоцитарного. Нейтрофилы у рептилий отсутствуют, и этот термин для них неприемлем (Васильев, 2005), хотя ошибки в названиях встречаются (Aguna, 1975). Гетерофилы рептилий, как и птиц, по сравнению с гомологичными им нейтрофилами млекопитающих, окрашиваются эозинофильно. У большинства рептилий, за исключением некоторых ящериц и змей, имеется второй тип гранулоцитов, окрашивающихся ацидофильно. В связи с этим, иногда применяют термин «ацидофил» к обоим типам клеток и к гетерофилам, и к эозинофилам. Ацидофилы рептилий имеют широкую видоспецифичную вариабельность в размерах, морфологии ядер и гранул. Черепахи и крокодилы имеют 2 типа ацидофилов, которые, по одним данным, происходят из единого клеточного ствола и соответствуют нейтрофилам и эозинофилам млекопитающих. По другим источникам каждый тип клеток происходит от независимых клеток предшественников (эозинофильного и гетерофильного) и называют эти клетки «эозинофил» и 11

12 «гетерофил» - такая терминология сейчас принимается большинством авторов (Васильев, 2005; Canfield, 1998; Montali, 1988; Zapata and al., 1981). У чешуйчатых (ящерицы, змеи) второй тип ацидофилов (эозинофилы) встречается редко (Alberio and al., 2005; Carvalho and al., 2006), например, у Elaphe obsoleta они не отмечены вообще (Bounous and al., 1996), как и у бородатой агамы Pogona vitticeps (Eliman, 1997). Для Bothrops ammodytoides описано преобладание эозинофилов над гетерофилами (Trojano and al., 1999). По литературным данным у гетерофилов ящериц может быть более одного предшественника (Васильев, 2005); вопрос остается открытым. Особенностью гемопоэза рептилий является сезонность (Соколина и др., 1997). Весной, после выхода из зимней спячки наблюдается резкая вспышка эритропоэза в костном мозге. К осени происходит его постепенное затухание, а зимой эритропоэз прекращается полностью. Однако для гремучих змей Crotalus durissus были отмечены возрастание содержания эритроцитов, концентрации гемоглобина и гематокрита в крови в зимнее время, в то время как количество лейкоцитов и тромбоцитов увеличивалось в летнее время (Trojano and al., 1997). У некоторых видов ящериц наблюдается вторая волна эритропоэза осенью, которая затухает к зиме. К концу зимней спячки у рептилий на фоне длительного угнетения эритропоэза в костном мозге, вызванном снижением синтеза гемоглобина при низких температурах, увеличения содержания в крови доли мелких эритроцитов и их распада наблюдается снижение содержания гемоглобина в крови (Гильмутдинов, Курбанов, 1999). Для обыкновенного ужа было показано, что весной уровень гемоглобина и количество эритроцитов в крови выше, чем летом. Более высокий гемоглобин и большее содержание эритроцитов может быть адаптацией на возможную гипоксию в зимовальных убежищах, особенно в состоянии скученности (Ганщук, Литвинов, 2004). В отличие от эритропоэза, лейкопоэз осуществляется и в зимний период, однако его интенсивность бывает резко сниженной (Mussart and all., 2006). 12

13 Имеются так же данные о влиянии повышенного уровня тестостерона на процессы эритропоэза и лейкопоэза и ингибировании их у Psammodromus algirus (Puerta and al., 1996). У зеленых игуан Iguana iguana в стабильных условиях без сезонных изменений температуры, влажности и освещения гематологические показатели остаются неизменными даже по прошествии длительных сроков (Pejrilova and al., 2004). Имеются предположения о связи эритро - и лимфопоэза у рептилий с деятельностью печени, в которой обнаруживаются миелоидные очаги. У змей главным органом гемопоэза является селезенка, где осуществляется эритро-, тромбо-, лимфо-, и моноцитопоэз, в то время, как костный мозг выполняет только гранулопоэтическую функцию, хотя последние данные говорят о том, что в костном мозге рептилий образуются не только гранулоциты (Dabrowski and al., 2007; Sigueko Sano-Martins and al., 2002; Tabarowski and al., 2007). У черепах и ящериц кроветворение происходит в костном мозге и селезенке (Соколина и др., 1997; Гильмутдинов, Курбанов, 1999) и частично в тимусе (Leceta and al., 1984). Для прыткой ящерицы характерны следующие характеристики крови: содержание гемоглобина достигает 7,8 г на 100 мл крови; количество эритроцитов у прыткой ящерицы составляет в мм³. крови; РОЭ 4 мм в час, гемоглобин 11,5%. Общий объем крови в организме прыткой ящерицы составляет около 6,3%. У прыткой ящерицы отмечено несколько фракций крови, различающиеся по соотношению белков альбуминов и глобулинов. Количество этих белков колеблется в зависимости от популяции (Антипчук и др., 1976). Диаметр эритроцитов прыткой ящерицы достигает 12,76 мкм, средний диаметр эритроцитов самцов больше, чем у самок (Дробот, Жгулева, 2005). Авторы отметили, что в зависимости от качества окружающей среды диаметр эритроцитов может изменяться. У ящериц, отловленных в зонах с промышленным загрязнением, средний диаметр эритроцитов составил около 13

14 11,83 мкм, а средний диаметр эритроцитов ящериц из условно чистой зоны достигал 12,76 мкм. Отмечено увеличение частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами по мере увеличения антропогенной нагрузки на среду. По некоторым данным (Metin and al., 2006) высокое содержание в крови эритроцитов с микроядрами может служить признаком генетического отклонения и патологических процессов в организме животного. С.Н. Тарасенко (1989) установил зависимость количества гемоглобина, эритроцитов, гематокрита и белка от качества окружающей среды. По результатам его работ выяснилось, что в зоне интенсивного промышленного загрязнения перечисленные показатели выше в 1,3; 1,6; 1,4 и 2,5 раза соответственно. Отмечено снижение количества липидов в крови в 2 раза, что, по-видимому, связано со значительными энергетическими расходами организма, необходимыми для детоксикации поступающих ингредиентов промышленных отходов. Таким образом, морфологические показатели крови рептилий могут быть использованы при оценке качества среды (Дробот, Жгулева, 2005; Павлов, 1998; Тарасенко, 1989). 14

15 Методика исследований. Сбор материала для морфологического анализа можно проводить как в полевых, так и в лабораторных условиях. В последнем случае необходимо учитывать, что взятие крови необходимо провести как можно скорее, поскольку общая картина крови может сильно измениться в результате воздействия стресса на животное. Для сбора материала в полевых условиях необходимо иметь элементарную походную лабораторию, в составе которой могут находиться складной рабочий столик любой конструкции и небольшой ящик с материалами и оборудованием. Обработка предметных стекол. Микроскопически исследования форменных элементов крови рептилий, как и других позвоночных и человека, проводят на окрашенных препаратах с применением иммерсионного объектива. Следовательно, кроме знаний морфологического строения клеток крови рептилий успех работы зависит и от того, как приготовлены препараты, каково их качество, насколько они удачно зафиксированы и окрашены. Определенное значение имеет качество предметных стекол, их толщина, обработка. Предметные стекла, используемые для изготовления мазков, должны быть подготовлены и тщательно обработаны заранее. Качественные мазки получаются лишь в том случае, если стекла хорошо обезжирены. С этой целью обычно применяют этиловый спирт. Стекла тщательно просушивают чистой хлопчатобумажной тканью. При протирке и других операциях необходимо держать стекла только за ребра, не касаясь их рабочих поверхностей. Взятие крови. Способы получения крови у рептилий определяются целями и задачами исследований и анатомическими особенностями объекта. При необходимости получения большого объема крови единовременно (при исследованиях, требующих получение сыворотки, плазмы крови и т.д.) используют метод декапитации (отсечения головы). При этом возможен практически полный забор крови из организма животного. Однако, учитывая, 15

16 что некоторые виды рептилий находятся под охраной, а также при необходимости проведения долгосрочных наблюдений за гематологическими показателями изучаемых особей, практикуются другие методы. Для морфологического анализа требуется сравнительно небольшое количество крови, которое можно получить из поверхностно лежащих сосудов. У рептилий, в частности у змей, в этом случае наиболее удобны сосуды полости рта (Соколина и др., 1997). Другой широко распространенный метод - взятие крови, выступающей при отрезании кончика хвоста у змей или пальцев конечностей у ящериц (рис. 2 a, b). а b Рис. 2. Способы забора крови у ящериц: a путем отсечения когтевой фаланги пальца задней конечности; b путем отсечения кончика хвоста. Такая техника позволяет получить кровь до нескольких раз от одной особи у всех видов пресмыкающихся. Однако малая насыщенность хвоста сосудами и их мельчайшие размеры позволяют получить ограниченный объем пробы. По нашим наблюдениям, этот метод неприменим к ломкой веретенице. 16

17 Хвост большинства ящериц, в том числе и прыткой ящерицы, обладает способностью аутотомии, т.е. отбрасывается при нападении хищника. Этот механизм отточен миллионами лет эволюции, поэтому не причиняет серьезного ущерба здоровью ящерицы и, по-видимому, не вызывает особых неудобств. Кровеносные сосуды в месте перелома довольно быстро сужаются, минимизируя кровопотери. Однако выделяющегося объема крови иногда бывает достаточно, что бы сделать 1-2 хороших мазка. В дальнейшем, как известно, хвост большинства ящериц способен к регенерации. При заборе крови методом отсечения когтевой фаланги четвертого пальца задней конечности или последней трети хвоста ящерицы необходимо иметь маленькие и хорошо заточенные маникюрные ножницы. Для улучшения кровотока температура тела животного должна быть примерно С, поэтому перед забором крови животное в хлопчатобумажном мешочке необходимо поместить в условия с указанной температурой. Фиксация ящерицы осуществляется пальцами левой руки, при этом животное переводится в вертикальную позицию головой вверх. Для улучшения притока крови в нижнюю часть тела можно слегка помассировать ящерицу указательным пальцем правой руки по брюшку в направлении от головы к хвосту. Хвост ящерицы лучше отсекать в его последней трети, поскольку в этой части еще сохраняется довольно большое количество сосудов, к тому же нет необходимости отсекать хвост полностью. Сохранение как можно более целого хвоста имеет важное значение для ящериц, поскольку хвост играет большую роль в защите ящерицы от нападения хищников (аутотомия), а у некоторых видов (например, у гекконов) участвует в запасании питательных веществ. В случае если кровь выступает совсем немного, можно слегка помассировать хвост от основания к концу, либо отсечь еще примерно 0,5 см хвоста. 17

18 В заключении процедуры отбора крови задняя часть тела ящерицы переводится в вертикальную позицию для уменьшения притока крови. В таком положении животное выдерживается 3-5 минут, с одновременной обработкой пальца или хвоста (в зависимости от выбранной методики) 10 % раствором перекиси водорода. Изготовление мазков. Для изготовления тонкого мазка крови на край предметного стекла наносят небольшую каплю крови, перед которой ставится под углом 45 другое более узкое отшлифованное стекло, которое отодвигают назад до соединения с каплей крови так, чтобы она растеклась между краем шлифованного и поверхностью предметного стекла (рис. 3 а). Затем медленным движением производят мазок. Чтобы он был равномерным, большой и указательный пальцы, скользя по краям предметного стекла, должны слегка опираться на них. При таком положении рука достигает достаточной устойчивости и мазок получается равномерным. Считают, что при правильном изготовлении мазок должен заканчиваться, не достигая 1,5 см до края стекла. Ещё один метод изготовления мазков крови основан на использовании не шлифованного стекла, а покровного. В этом случае покровное стекло кладется на каплю крови перпендикулярно предметному стеклу. Капля растекается между двумя стеклами и затем производится мазок (рис. 3 b.). Однако данная методика используется редко. Рис. 3. Способы изготовления мазков крови. 18

19 Правильный мазок имеет равномерную толщину и заканчивается «щеточкой» (рис. 4 а). Рис.4. Различные виды мазков крови. При преждевременном прерывании мазка (что является нарушением технологии изготовления мазка) он не имеет такой «щеточки» (рис. 4 с). Обычно при этом мазок получается слишком густым. Густые мазки получаются и в том случае, если капля крови оказалась слишком большой (рис. 4 b). Напротив, если капля крови оказалась очень маленькой, или рептилия страдает анемией, то получаются слишком маленькие мазки (рис. 4 d), которые также малопригодны для изучения. Фиксация мазков. Подписанные мазки крови оставляют для просушки, после чего производят фиксацию и окраску препаратов. В качестве простейшего фиксатора можно использовать неразведенный этиловый спирт. С этой целью просушенные препараты попарно мазками наружу ставят на узкое ребро стекла в небольшой сосуд или стаканчики и заливают фиксатором. Время фиксации в этиловом спирте около 30 минут. Затем мазки высушивают на воздухе. 19

20 Фиксация мазков в этиловом спирте помогает сохранить их довольно длительное время, особенно, если нет возможности покрасить мазки сразу. При массовой фиксации целесообразно использовать большие кюветы. Окраска препаратов. В идеальном случае окраску, как и фиксацию препаратов, следует проводить сразу после изготовления и просушки мазка. Наиболее доступным методом является окраска азурэозином по Романовскому Гимза. Готовый краситель азурэозин по Романовскому предварительно разбавляют дистиллированной водой из расчета одна капля красителя на 1 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор красителя готовят непосредственно перед употреблением. Время окраски мин. Следует отметить, что качество окраски зависит от многих параметров, поэтому желательно окрашивать мазки небольшими партиями по 2-3 штуки, начиная с 15 мин и увеличивая время покраски до 30 мин. Далее определяется наиболее оптимальное время покраски и красится вся партия мазков. После покраски препараты хорошо прополаскивают сначала дистиллированной, а потом простой водой и оставляют для просушки. Готовые сухие препараты необходимо переложить бумагой каждый в отдельности. При длительном хранении их складывают на ребра в специально приготовленные коробки, так как в таком виде их лучше и безопаснее транспортировать. Хранят препараты в темном месте. Подсчет формулы крови. При подсчете лейкоцитарной формулы дифференцировка форменных элементов производится на удачно окрашенном мазке под иммерсионным объективом. Окуляр при этом следует брать не самый большой: наибольшая четкость достигается при окуляре 7. Для подсчета лейкоцитарной формулы пользуются счетной машинкой (рис.5). На мазках крови подсчитывают подряд все встречающиеся в поле зрения форменные элементы крови и на бланке отмечают в зависимости от 20

21 их принадлежности к тем или иным группам. Затем вычисляют их процентное содержание. Рис. 5. Счетная машинка для подсчета лейкоцитарной формулы. Так как форменные элементы из-за их различного удельного веса размещаются на разных участках препарата, в середине мазка, например, будут преимущественно находиться лимфоциты, по краям нейтрофилы и т.д. Поэтому подсчет нужно вести двигаясь вдоль мазка попеременно то в вертикальном, то в горизонтальном направлениях. Всего в мазке подсчитывают двести клеток белой крови, после чего вычисляют процентное соотношение. Измерение диаметров форменных элементов крови. Измерение форменных элементов производится окулярмикрометром и объектмикрометром. Абсолютную величину одного деления окулярмикрометра определяют с помощью объектмикрометра. Для этого предметное стекло объектмикрометра с нанесенной по его центру шкалой помещают на столик, а окулярмикрометр в тубус микроскопа. При этом нулевые деления объектмикрометра и окулярмикрометра должны совпадать. Пример. 50 делений окулярмикрометра совпали со 100 делениями объектмикрометра. 1 дел. = 100 : 50 = 2 мкм. Чтобы узнать величину клетки в микрометрах, надо ее размеры, выраженные в окулярмикрометрах, перемножить на абсолютную величину одного деления, в данном случае на 2 мкм. 21

22 Характеристика форменных элементов периферической крови прыткой ящерицы L. agilis. Эритроцитарный ряд В мазках крови прыткой ящерицы отмечаются различные стадии развития эритроцитов. Встречаются клетки округлой формы с цитоплазмой синих тонов и нежным ядром эритробласты и нормобласты. В клетках этой стадии нередко можно наблюдать процесс митоза. По литературным данным юные эритроциты характерны, прежде всего, для молодых особей. Их количество может возрастать также при линьке, анемиях и кровопотерях (Васильев, 2005). Эритробласты представляют округлые клетки с большим нежным ядром из-за слабой выраженности хроматина, содержащее ядрышки (рис. 6 а). Цитоплазма базофильна, окрашивается неравномерно. Размеры их довольно крупные - 12,6±0,8 мкм. Обладают способностью к митозу. Нормобласты являются следующей стадией развития эритроцитов (рис. 6 б). Клетки имеют более вытянутую форму, чем клетки предыдущей стадии, и превышают размеры эритробласта. Базофилия цитоплазмы на этой стадии уменьшается, ядро приобретает грубую структуру хроматина. Нормобласт способен делиться митотически и в тоже время накапливать гемоголобин; воспринимает кислые и основные красители, в зависимости от количества гемоглобина. Размеры клетки составляют 12,9±1,0 х 9,5±0,4 мкм. Полихроматофильный нормоцит имеет овально-эллиптическую форму с гладкими наружными очертаниями (рис. 6 в). Цвет цитоплазмы меняется по мере накопления гемоглобина в направлении: базофильно-серый - серожелтый - розово-оранжевый. 22

23 а) г) б) д) в) е) Рис. 6. Клетки эритроцитарного ряда прыткой ящерицы (Ув ): а - эритробласт (митоз); б нормобласт; в - полихроматофильный нормоцит; г - зрелые эритроциты; д - эритроциты с нормальным (1) и пикнотическим (2) ядром; е эритроциты, пораженные Karyolysus lacertae (Danilewsky 1889). У зрелых эритроцитов - розово-красный (розово-оранжевый) цвет (рис. 6 г). Эритроциты (оксифильные нормоциты) рептилий имеют овально эллиптическую форму с гладкими очертаниями. Длина взрослых эритроцитов прыткой ящерицы - 15,01±0,03 мкм, ширина - 8,93±0,03 мкм (табл. 2). 23

24 Размерные характеристики клеток периферической крови прыткой ящерицы Lacerta agilis exigua. Таблица 2 Тип клетки n показатель min max M m Эозинофил 30 d 11,2 16,8 14 0,27 Гетерофил 30 d 11,2 15,4 14,09 0,25 Базофил 30 d 7 11,2 9,42 0,21 Вакуолизированная клетка 30 d 8,4 18,2 13,20 0,50 Азурофил 30 d 8,4 15,4 11,66 0,39 Моноцит 30 d 15,4 16,8 16,33 0,46 Лимфоцит 100 d 5,6 11,2 9,18 0,14 Плазматическая клетка 30 Тромбоцит 30 l 11, ,07 0,45 h 7 11,2 8,57 0,61 l 8,4 9,8 8,72 0,10 h 4,2 8,4 6,06 0,22 Эритроцит 7425 l 13,66 17,75 15,01 0,03 h 7,33 13,10 8,93 0,03 d диаметр клетки (мкм), l длина клетки (мкм), h ширина клетки (мкм). Вокруг ядра и по краям клетки окраска более интенсивная, что связано с неодинаковой плотностью цитоплазмы. Ядро у молодых клеток повторяет их форму. Ядра эритроцитов имеют длину 5,95±0,01 мкм и ширину 2,85± 0,009 мкм. Хроматин ядра располагается в виде тесно друг возле друга лежащих равномерных мелких глыбок на общем сине-голубом фоне. Значительную долю взрослых эритроцитов составляют клетки, имеющие много выростов и инвагинаций ядра, иногда доходящих до полной сегментации. В среднем, размеры эритроцитов самок больше, чем у самцов, однако статистически различия подтверждены только для ширины эритроцитов (табл. 3). 24

25 Таблица 3 Размерные характеристики эритроцитов самцов и самок прыткой ящерицы. Параметры эритроцитов самки самцы n = 229 n = 137 M +m 15,04 + 0,03 14,98 + 0,04 Длина Med 15,01 14,95 min-max 13,6-17,5 13,8-16,7 M +m 8,90 + 0,03 9,02 + 0,06 Ширина Med 8,85 8,90 min-max 7,9-10,4 7,3-13,1 M +m 5,92 + 0,02 6,0 + 0,03 Длина ядра Med 5,88 5,94 min-max 4,7-7 4,9-7,5 M +m 2,85 + 0,007 2,86 + 0,02 Ширина ядра Med 2,80 2,8 min-max 2,8-3,6 2,2-4,8 t (p<0,05) 0,929 0,021 0,102 0,622 Эритроциты прытких ящериц, отловленных на трансформированных территориях (промышленная зона города, зона многоэтажной застройки и частный сектор), характеризуются большими значениями длины и ширины, чем клетки особей, отловленных на пригородных слаботрансформированных участках и в контрольной зоне. Однако в литературе встречаются противоположные результаты (Дробот, Жгулева, 2005). Наблюдаемые нами различия в размерах клеток подтверждены статистически (табл. 4). Возможно, что увеличение размеров клеток имеет адаптивное значение в условиях антропогенного воздействия, в виде своеобразной реакции организма в условиях стресса, вызванного внешними факторами. Увеличение размеров клетки приводит к увеличению ее объема, что может быть следствием роста интенсивности обменных процессов, происходящих в клетке и, по-видимому, связано со значительными энергетическими расходами организма, необходимыми для детоксикации поступающих ингредиентов, особенно в промышленной зоне города. 25

26 Размерные характеристики эритроцитов прыткой ящерицы с различных участков г. Казани. Таблица 4 Параметры эритроцитов Длина Ширина Длина ядра Ширина ядра Промышленная зона и жилой сектор города Приграничные участки, парки, охраняемые территории n=222 n=130 M + m 15,05 + 0,03 14,96 + 0,04 Med 15,01 14,95 min-max 13,8-17,7 13,6-16,8 M + m 8,95 + 0,04 8,88 + 0,05 Med 8,85 8,79 min-max 7,3-12,8 8,0-13,1 M + m 5,98 + 0,02 5,93 + 0,02 Med 5,94 5,88 Min-max 4,7-7,5 5,1-6,6 M + m 2,87 + 0,01 2,84 + 0,008 Med 2,80 2,80 min-max 2,2-4,8 2,8-3,5 t (p<0,05) 0,005 0, ,340 0,057 В крови прыткой ящерицы отмечаются эритроциты с видоизмененными пикнотическими ядрами (рис. 6 д). Ядра приобретают округлую форму и уменьшаются в размерах (табл.5). Некоторые характеристики эритроцитов прыткой ящерицы с пикнотическими ядрами. Таблица 5 Параметры n=100 (мкм) M m min max длина эритроцита 14,54 0, ,6 ширина эритроцита 9,20 0,090 7,9 11,2 длина ядра 3,14 0,030 2,3 3,8 ширина ядра 3,04 0,027 2,2 3,8 Хроматин их сильно уплотнен и имеет густую темно-синюю окраску. Размеры клеток, как видно из рисунка 6, так же имеют меньшие размеры, по сравнению с нормальными эритроцитами. 26

27 Г.С. Марков (1979) отмечает связь между инвазией кариолизусом и наличием в периферической крови прыткой ящерицы таких эритроцитов. Однако мы в своих исследованиях не наблюдали подобной связи. Большой процент таких клеток был отмечен у особей, отловленных в промышленной зоне. Для этой территории характерна наименьшая частота встречаемости зараженных кариолизусом особей. Возможно, причиной появления подобных клеток является промышленное загрязнение среды. Клетки тромбоцитарного ряда Тромбобласты прыткой ящерицы представлены клетками с опоясывающей ядро цитоплазмой от светло-серого до светло-голубого, чаще прозрачного цвета (рис. 7а). Они имеют овальную форму, практически все пространство клетки заполнено ядром, имеющим однородную структуру и окрашенным в розовый цвет. а) б) Рис.7. Клетки тромбоцитарного ряда прыткой ящерицы (Ув ): а тромбобласт; б тромбоциты. У части клеток этой стадии проявляется перинуклеарная зона. Контуры цитоплазмы иногда принимают неправильный или рваный вид в результате образования псевдоподий. Образования в виде длинных узких выпячиваний цитоплазмы чаще наблюдается у более развитых тромбобластов. У этих 27

28 клеток хроматин ядра сгущается, становится комковатым. Контуры цитоплазмы приближаются к эллипсоидной. Тромбоциты прыткой ящерицы, как и у других пресмыкающихся, имеют овальную форму, однако форма их может меняться в связи с образованием псевдоподий (рис. 7б). Цитоплазма чаще всего бесцветна и представлена узким ободком вокруг ядра. Ядро окрашено в сине-фиолетовые тона и имеет отчетливо выделяющиеся глыбки хроматина. Для тромбоцитов характерно образование агрегаций, что облегчает их определение. Размеры тромбоцитов прыткой ящерицы следующие: длина - 8,72±0,10 мкм, ширина - 6,06±0,22 мкм (табл. 2). Клетки лимфоидного ряда Кровь прыткой ящерицы имеет лимфоцитарный профиль, поскольку клетки этого ряда доминируют среди лейкоцитов в количестве. Лимфобласты прыткой ящерицы представлены клетками с крупным овальным или округлым ядром, занимающим около 70-80% площади клетки, широкого ободка цитоплазмы. Степень базофилии последнеей равномерно увеличивается от ядра к клеточной мембране. Ядро располагается центрально, либо несколько децентрализовано. Периферический хроматин выражен слабо и конденсируется возле ядерной мембраны. Постоянным структурным компонентом ядра лимфобласта является гипертрофированное ядрышко, четко выделяющееся на общем светлом фоне (рис. 8 а). Размеры колеблются в пределах 12,8±1,0 мкм. Форма лимфоцитов варьирует от округлой до звездчатой и бесформенной за счет образования псевдоподий (рис. 8 б). Цитоплазма окрашена голубовато-серые тона и нередко представлена лишь узким ободком. Ядро, чаще всего неправильной формы, окрашено сине-фиолетовые тона и имеет скопления хроматина. Размеры этих клеток варьируют от 5,6 мкм до 11,2 мкм (M= 9,18±0,14 мкм) (табл. 2). 28

29 а) в) б) г) Рис. 8. Клетки лимфоцитарного ряда прыткой ящерицы (Ув ): а лимфобласт; б лимфоцит; в, г плазматические клетки. Плазматические клетки рептилий являются производными лимфатического ряда (Соколина и др., 1997; Васильев, 2005) (рис. 8 в, г). У прыткой ящерицы клетки этого типа имеют удлиненную форму, длина этих клеток составляет 12,07±0,45 мкм, ширина 8,57±0,61 мкм (табл. 2). Цитоплазма окрашена интенсивно базофильно. Вокруг ядра имеется зона просветления. Ядро располагается несколько эксцентрично. Оно окрашено базофильно и имеет множество гранул хроматина, неравномерно распределенных по площади ядра. Клетки моноцитарного ряда. Монобласт предшественник моноцита - сравнительно крупная округлая клетка с ядром неправильной формы. По нежной структуре и наличию ядрышек ядро монобласта близко к строению такового 29

30 миелобласта. Цитоплазма монобласта окрашивается базофильно, варьируя в оттенках. Зрелый моноцит обладает ядром неправильной (бобовидной или округлой) формы, как правило, расположенным эксцентрично. Моноциты в периферической крови рептилий встречаются в небольших количествах (Хамидов и др., 1978; Соколина и др., 1997; Васильев, 2005). Это подтверждается и нашими данными. Отмечено, что инфекция некоторыми простейшими группы Hematozoa, например Lainsonia (Landau, 1973) (Lankestereliidae) может спровоцировать повышенное образование моноцитов (моноцитоз) и их морфологические изменения (Silva and al., 2004). Клетки этой группы в большинстве случаев являются наиболее крупными, хотя имеются и исключения (Mussart and al., 2006). Диаметр их у прыткой ящерицы составляет 16,33±0,46 мкм (табл. 2). Ядро имеет овальную или бобовидную форму и смещено к краю клетки. Цитоплазма окрашена в голубовато-серые тона (рис. 9а). а) б) Рис. 9. Клетки моноцитарного ряда прыткой ящерицы (Ув ): а моноцит; б - азурофил. Азурофилы также являются представителями моноцитарного ряда, они меньше по своим размерам - 11,66±0,39 мкм (табл. 2), имеют округлую форму (рис. 9 б). Ядро азурофила резко очерченное округлое или слегка овальное, окрашенно в сине-фиолетовый цвет и расположенное несколько 30

31 эксцентрично. На фоне ядра хорошо заметны темные гранулы хроматина. Цитоплазма клеток голубовато-серого цвета обильно заполнена мелкой зернистостью, которая напоминает прозрачные вакуоли. Гранулоциты. Миелобласт светооптически имеет эксцентрично расположенное ядро. Цитоплазма базофильна, азурофильно гарнулированна в небольшом количестве, иногда вакуолизированна, нешироким и неравномерным на своем протяжении ободком окружает ядро клетки (рис. 10 а). а) б) Рис. 10. Молодые гранулоциты прыткой ящерицы (Ув ): а миелобласт; б миелоцит. Ядро имеет удлиненную или округлую форму. Наибольшие скопления ядерного хроматина распределены по всей кариоплазме с некоторой тенденцией размещения к периферии. Ядрышко имеет гипертрофированный вид. Хроматин ядра распределяется в однородную нежную структуру. Размеры составляют приблизительно 14,8±0,7 мкм. Миелоциты представлены клетками, имеющими специфическую зернистость, разбросанную по всей площади цитоплазмы, и в зависимости от типа клетки, окрашенную в определенные тона гетерофильную, эозинофильную либо базофильную (рис. 10 б). 31

32 В части клеток этого ряда зернистость может не проявляться или проявляется локально. Ядро миелоцита имеет, то округлую, то овальную форму с несколько неправильными очертаниями и, как правило, расположено эксцентрично. Размеры колеблются в пределах 14,5±1,0 мкм. Среди клеток гранулоцитарного ряда принято выделять три типа нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. По мнению ряда авторов (Хамидов и др., 1978; Хамидов и др., 1979; Соколина и др., 1997; Васильев, 2005; Montali, 1998) у рептилий клетки первого типа отсутствуют, и заменены гетерофилами, несущими ту же функцию, что и нейтрофилы млекопитающих. Для некоторых видов черепах выделяют два типа эозинофилов, которые по своим характеристикам соответствуют эозинофилам и гетерофилам (нейтрофилам) млекопитающих (Azevedo and al., 2003). Зрелые гетерофилы прыткой ящерицы имеют округлую форму (рис. 11 а, б, в). Цитоплазма гетерофилов окрашена слабо-базофильно в бледно-серый цвет. В цитоплазме присутствует обильная нейтрофильная и очень мелкая, пылевидная зернистость бледно-розового цвета. Ядро зрелых клеток сегментировано на две-четыре части и располагается эксцентрично. Окрашено оно в розово-фиолетовый оттенок. Диаметр гетерофила составляет 14,09±0,25 мкм (табл.2). Эозинофилы (рис. 11 г, д, е) прыткой ящерицы имеют округлую форму диаметром 14±0,27 мкм. Ядро обычно компактное, либо разделено на два сегмента. Располагается оно на периферии клетки. Окрашено ядро в фиолетово-розовый цвет. Цитоплазма обильно заполнена особыми гранулами, окрашенными эозинофильно в золотисто-оранжевые тона. Третий тип гранулоцитов базофилы (Рис. 12 а, б, в), представлены в крови прытких ящериц небольшими клетками диаметром 9,42±0,21 мкм. Основная особенность этих клеток - наличие яркоокрашенных базофильных гранул, занимающих практически все пространство клетки и, частично, прикрывающих ядро базофила. Цитоплазма окрашена в фиолетовые тона, 32

33 ядро фиолетово-розового цвета, округлое и часто слаборазличимо под гранулами. а) г) б) д) в) е) Рис. 11. Зрелые гранулоциты прыткой ящерицы (Ув 10000): а, б, в гетерофилы, г, д, е эозинофилы. 33

34 а) г) б) д) в) е) Рис. 12. Зрелые гранулоциты прыткой ящерицы (Ув ): а, б, в базофилы; г, д, е различные стадии обесцвечивания гранул базофила и образования «вакуолизированных» клеток. В крови прыткой ящерицы встречаются клетки с обильно вакуолизированной цитоплазмой (рис. 12 г, д. е). Они имеют крупные размеры - 13,20±0,50 мкм (табл.2). Ядро, как правило, занимает центральное положение, интенсивно окрашено в фиолетово-розовые тона. На фоне ядра заметны темные гранулы. Возможно, что это либо глыбки хроматина, либо гранулы наподобие гранул базофилов. 34

35 Цитоплазма вакуолизированных клеток окрашена в слабый фиолетоворозовый цвет и содержит большое количество бесцветных, либо бледнорозовых гранул, придающих клетке «вспененный» вид. О родстве этих клеток базофилам, на наш взгляд, говорит наличие в мазках клеток промежуточного типа, являющих собой переходные формы от базофилов к «вакуолизированным» клеткам. Клетки подобного типа отмечены у костнохрящевых и костистых рыб (Иванова, 1983). Они отнесены к гранулоцитам с псевдобазофильной зернистостью. Д.Х. Хамидов с соавторами (1978; 1979) указывают на наличие в крови степной черепахи Agrionemys horsfieldi базофилов, зрелые формы которых содержат опустошенные гранулы, имеющие вид вакуолей. Подобные клетки были отмечены для обыкновенной гадюки Pelias (Vipera) berus (Павлов, 1998). Аналогичное явление, наблюдаемое в базофилах крови человека, связывается с водорастворимостью содержимого гранул, происходящей в процессе фиксации и окраски мазка (Алмазов и др., 1978). О родстве этих клеток с базофилами говорят и результаты изучения лейкоцитов крови водяной агамы Physignathus concincinus (Mayer and al., 2005). Межполовые различия по количеству лейкоцитов в мазках крови (ед./100 клеток) прыткой ящерицы статистически подтверждены лишь для базофилов и лимфоцитов. Различия между количеством вакуолизированных клеток и азурофилов приближаются к статистически достоверным значениям. Самцы характеризуются меньшим количеством базофилов в крови. У самок в крови преобладают вакуолизированные клетки, которые, по нашему мнению, предсталяют собой модификацию базофилов, и азурофилы, являющиеся представителями моноцитарного ряда. Для самцов в среднем характерно большее количество лимфоцитов, по сравнению с самками (табл. 6). 35

36 Таблица 6 Встречаемость различных форменных элементов в мазках периферической крови самцов и самок прыткой ящерицы (ед/100клеток). Тип клетки Самцы n=137 Самки n=229 U-критерий Уилкоксона (р<0,05) Вакуолизированные клетки Моноциты Азурофилы Гетеро- M+m Med min max M+m Med min max филы 6,9 + 7, ,61 0, ,103 Эозинофилы 0,56 0,45 6,7 + 7, ,068 Базофилы 2,4 + 3, ,31 0, ,002 Лимфоциты Плазматические клетки 9,08 + 0,61 0,16 + 0,04 3,08 + 0,30 70,9 + 0,97 0,25 + 0, , ,5 + 0,53 0,33 + 0,05 3,48 + 0,25 66,2 + 0,81 0,35 + 0, , , , , ,237 Примечание: курсивом выделены значения, близкие к достоверным. У рептилий, как и у других позвоночных, базофилы связываются с поверхностью иммуноглобулинов и реагируют дегрануляцией, высвобождая гистамин (Sypek, Borisenko, цит. по Васильеву, 2005). В норме их количество в крови незначительно, а их сезонные колебания не выражены. Однако их количество может повышаться при некоторых кровепаразитарных заболеваниях (инвазии гемогрегарин и трипаносом) или иридовирозах. В таких случаях можно наблюдать в крови ящериц деграниулированные базофилы. Преобладание в крови самок прыткой ящерицы базофильных и вакуолизированных клеток можно объяснить специфической реакцией на какой то фактор. Таким фактором, на наш взгляд, может служить инвазия Karyolysus lacertae, которая у самок отмечается значительно чаще, чем у самцов. 36

37 Азурофилы, являясь клетками моноцитарного ряда, так же активно участвуют в иммунном ответе организма. Если в норме их количество не превышает 10 % (в среднем 3-7 %), то при антигенной стимуляции их уровень резко возрастает. Повышенный уровень клеток этого вида характерен при хронических инфекциях, травмах, паразитозах (Васильев, 2005). Таким образом, преобладание азурофилов у самок также может быть связано с большей пораженностью особей этого пола кровепаразитами. 37

38 Зараженность прыткой ящерицы паразитом крови Karyolysus lacertae (Danilewsky 1889) Паразитизм широко распространен среди представителей Protozoa. Поскольку паразитические простейшие имеют малые размеры и повсеместное распространение, их хозяевами стали все типы Metazoa. Особый интерес вызывают кровепаразиты. Фауна простейших, паразитирующих в организме пресмыкающихся, и, в частности, ящериц чрезвычайно разнообразна. Из известных 7 типов она представлена Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliophora, Microspora. Лишь некоторые из них патогенны. Большинство простейших являются компонентом нормальной кишечной фауны и проявляют патогенность при определенных условиях (Васильев, 2005; Silva and al., 2004). Среди внутриклеточных паразитов крови наиболее распространенными являются представители трех родов Haemogregarina, Hepatozoon и Karyolysus (Васильев, 1999; 2005; Ярофке, Юрген, 1999). В настоящее время описано более трехсот видов. В связи с простотой организации и малым количеством морфологических признаков у кровяных споровиков остро стоит вопрос о понятии вида. Признаки их настолько сходны или подвержены вариациям, что иногда кажутся синонимами. Внешне все эти паразиты имеют схожую внутриэритроцитарную форму. Как правило, они имеют колбасовидное или слегка изогнутое тело, крупное, центрально или терминально расположенное ядро седловидной формы. Чаще всего тело их лишено пигмента. Haemogregarina встречается лишь у водных рептилий - крокодилов и черепах (Васильев, 1999; 2005; Ярофке, Юрген, 1999). Основными переносчиками являются пиявки. В организме этих промежуточных хозяев не полицистические ооцисты образуют спорозоиты. Например, у H. balli меронты локализуются в эндотелии кровеносной системы, где из них образуются спорозоиты. При последующих кормлениях мерозоиты проникают в клетки печени, легких и селезенки дефинитивного хозяина, где 38

39 они проходят как минимум одну стадию первичной мерогнии, после чего мерозоиты атакуют эритроциты, где некоторые из них формируют многоклеточную стадию вторичных меронтов, а другие становятся гамонтами. Hepatozoon отличается от предыдущего рода двумя важными характеристиками: они не проходят стадию вторичной мерогонии в эритроцитах, а у трансмиссивных переносчиков спорозоиты развиваются из полицистических ооцист. После инвазии спорозоитов две генерации меронтов формируются в печени, легких, селезенке и других органах рептилий. Макромеронты образуют небольшое количество крупных мерозоитов, которые становятся микромеронтами. Мерозоиты, образующиеся из этого типа клеток, атакуют эритроциты, где превращаются в гамонты. Hepatozoon чаще всего инвазирует змей. Многие виды членистоногих способны поддерживать спорогонию этих паразитов. Основными переносчиками являются комары, москиты, триатомиды, гамазовые и иксодовые клещи и, возможно, пиявки (Васильев, 1999; 2005). Представители рода Karyolysus известны только у ящериц двух семейств Lacertidae и Scyncidae Старого Света. Кровяные простейшие резко отличаются от кишечных как по своей морфологии, так и по биологии. В теле кровепаразитов почти отсутствуют запасные питательные вещества. В небольшом количестве их можно встретить в макрогаметоцитах. Биология кровепаразитов определяется замкнутостью кровеносной системы. Инвазия идет из тела хозяина в тело переносчика и обратно. Поэтому у паразитов утрачивается потребность в защитных оболочках, и у кариолизуса выпадает стадия образования спор. Это подчеркивает то, как жизненный цикл зависит от особенности локализации кровепаразита. Представители этого класса сначала возникли в виде кишечных паразитов Vertebrata, а развитие полового поколения, видимо, происходило в переносчиках-кровососах. Затем главные моменты полового процесса переносятся с древнего хозяина в другого, позже включившегося в цикл. 39

40 Наступает период взаимного приспособления паразита и хозяина. Вырабатывается система равновесия между обоими организмами, позволяющая паразиту жить в хозяине, не принося ему вреда и не страдая от его ответных реакций. Смягчение действия повторной инвазии при сохранении в тканях ее латентной формы от первого заражения названо В.А. Догелем (1951) «нестерильным иммунитетом». Явление смены хозяев обеспечивает лучшее распространение паразита, усложняется его жизненный цикл, так как появляется промежуточный хозяин, в котором зародыш претерпевает очень сложные изменения. Это увеличивает шансы в борьбе за существование. Лишь попав в тело основного хозяина, он способен к развитию и образованию потомства. В промежуточном хозяине обычно идет развитие зародыша или личинок, а в окончательном паразит достигает половой зрелости и размножается половым путем. Доказана трансовариальная передача этих паразитов трансмиссивным хозяином гамазовым клещом Sauronyssus saurarum (Oudemans, 1902). Г.С. Марков с соавторами (1979) считают, что шизогония кариолизуса Karyolysus lacertae (Danilewsky, 1889) [синоним K. lacertarum (Danilewsky, 1889) Шарпило, 1976] протекает в клетках ретикулоэндотелия ящерицы, а половой процесс в теле клещей. Для кариолизуса характерно нетипичное деление, так как не обнаружена центросома, очень нечетко выглядит ахроматиновое веретено и поперечное деление хромосом. Для данного вида характерно множественное деление синтомия. Это многократное деление ядра, не сопровождающееся делением цитоплазмы плазмотомией. После определенного периода питания или роста ядро повторно делится. Организм становится многоядерным, ядра временно остаются необособленными, но вскоре плазматическое тело распадается на число особей в соответствии с количеством образовавшихся ядер. Далее после определенного периода питания и роста процесс повторяется. Образовавшиеся особи снова проникают в ретикулоэндотелиальные клетки ящерицы и проходят цикл 40

41 шизогонии. Этот цикл повторяется несколько раз. Появляются трофозоиты питающиеся особи, которые дают начало гамонтам. Для кариолизуса синтомия представляет стадию бесполого размножения, формирующую микрогаметоциты и макрогаметоциты. При повторноем делении, микрогаметоциты образуют 4 микрогаметы. Спаривание микро- и макрогаметоцитов происходит за счет активного сближения червеобразных мерозоитов последнего, прогамного поколения. Это стадия подготовки к половому размножению кариолизуса, так как процесс гамогонии приводит к образованию гамет. Спаренный с макрогаметоцитом микрогаметоцит делится на два округло-овальных тельца микрогаметы. Одна из них сливается с макрогаметой. В результате образуется зигота, которая у кариолизуса называется оокинетой. На этой стадии грегариноподобный кариолизус укорачивается и принимает округло-удлиненную форму. На стадии ооцисты кариолизус имеет округло-эллипсоидную форму. С началом деления в ооцисте ее размеры увеличиваются; спорозоиты кариолизуса удлиняются. Ооциста лопается и спорозоиты кариолизуса потоком гемолимфы разносятся по телу клеща. При укусе ящерицы клещом, спорозоиты со слюной попадают в ее тело. Появление полового процесса в жизненном цикле кариолизуса влечет за собой явление чередования диплоидных и гаплоидных фаз. Формы кариолизуса, которые можно встретить в эритроцитах ящериц, следует определять как трофозоиты и гамонты предполовые формы, развившиеся из мерозоитов заключительной генерации. При этом трофозоиты из периферической крови не превращаются в гамонтов. Гамонты образуются при агамном размножении в ретикулоэндотелии и, попадая в периферическую кровь, проникают в другие незараженные эритроциты. Таким образом, трофозоиты и гамонты являются представителями различных поколений в развитии кариолизуса в промежуточном хозяине - ящерице. Одним из признаков, указывающих на присутствие гемогрегарин, является наличие многоядерных форм в периферической крови и очевидное их 41

42 влияние на эритроциты: меняется их форма, клетка часто гипертрофируется, растягивается, увеличивается ядро. Одновременно с этим идет деструкция гемоглобина и наблюдается изменение сывороточных белков (Марков и др., 1979). Кариолизус имеет своеобразное строение в каждой стадии развития. При изучении мазков крови прыткой ящерицы, отмечаются как трофозоиты, так и гамонты Karyolisus lacertae (рис. 13, 14). На представленном ниже фото (рис. 13) мы можем наблюдать отчетливые различия между здоровыми и пораженными эритроцитами. Рис. 13. Трофозоит Karyolysus lacertae (Danylewsky, 1889) в эритроците прыткой ящерицы. Ув Паразит характеризуется вытянутым полупрозрачным телом, лишенным какой-либо капсулы. При этом оболочка паразита вступает в прямой контакт с ядром эритроцита. Г.С. Марков с соавторами (1979) делает предположение, что, мембранное взаимодействие является участником процесса избирательного проникновения веществ ядра эритроцита в тело активно питающегося паразита-трофозоита. Он расположен в клетке рядом с ядром, несколько охватывая его. Длина трофозоитов колеблется от 7,2 до 18,5 мкм, ширина от 1,4 до 6,4 мкм. Ядро расположено центрально, либо ближе к одному из полюсов. Длина колеблется от 2 до 3,7 мкм, ширина 42