Характеристика мезенхимальных стромальных клеток при раке молочной железы

Мезенхимальные стромальные клетки выделяли из жировой ткани, удаленной в ходе операций по поводу рака молочной железы, и культивировали в условиях нормального или пониженного содержания кислорода в газовой фазе. Пролиферативный потенциал мезенхимальных стромальных клеток пациенток, прошедших до операции курс лучевой и полихимиотерапии, был необратимо нарушен. Морфологические, ростовые, фенотипические и дифференцировочные характеристики мезенхимальных стромальных клеток пациенток, не получавших предоперационную терапию, не отличались от свойств мезенхимальных стромальных клеток здоровых доноров. При культивировании в условиях гипоксии способность к адипогенной дифференцировке мезенхимальных стромальных клеток доноров и пациенток становилась более выраженной.

Жировая ткань является источником мезенхимальных стромальных клеток (МСК), которые представляют собой популяцию малодифференцированных клеток-предшественников, обладающих высокой пролиферативной активностью [13,30]. Они способны к длительному самоподдержанию в условиях культуры, а также к дифференцировке в разные типы клеток [8,19,23,31].

МСК, выделенные из жировой ткани, рассматриваются в качестве возможного средства восстановительной клеточной терапии пациентов, подвергавшихся лучевой и полихимиотерапии [21]. МСК обладают низкой иммуногенностью [12] и свойствами иммуносупрессоров [22,25], поэтому при аллогенной трансплантации они не отторгаются. Однако с точки зрения биологических рисков клетки аутологичного происхождения считаются более безопасными.

Свойства МСК пациентов с различными заболеваниями исследованы недостаточно. В ряде работ показано, что МСК из костного мозга пациентов и здоровых людей обладают сходными характеристиками [4,6,15]. В то же время данные других авторов свидетельствуют в пользу частичного или полного нарушения функций МСК при различных заболеваниях [5,7,26]. Сведения о свойствах МСК, выделенных из жировой ткани пациентов с солидными опухолями, в литературе практически отсутствуют.

Для стандартизации определения МСК в 2006 году экспертами Международного общества клеточной терапии были предложены минимальные критерии, позволяющие относить изучаемые клетки к категории МСК [9]. Вопрос соответствия стволовых клеток пациентов со злокачественными новообразованиями этим критериям остается малоизученным.

Одним из важнейших факторов, модулирующих ростовые характеристики и дифференцировочные способности МСК при культивировании, является содержание кислорода в газовой среде [1,2,11,24]. При снижении его концентрации до 4-7% пролиферативная активность МСК жировой ткани здоровых доноров возрастала в 2.9 раза по сравнению с нормоксией [1,2]. Сведения о влиянии гипоксии на способность МСК к дифференцировке противоречивы. Имеются данные о стимулирующем действии гипоксии на процессы дифференцировки МСК в адипоциты и остеобласты [20,24]. В других исследованиях показано торможение дифференцировки МСК при снижении содержания кислорода [2,10,17]. Способность МСК, полученных от пациентов со злокачественными новообразованиями, к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлении также остается малоизученной.

Целью данного исследования являлось изучение ростовых, фенотипических и дифференцировочных характеристик МСК больных раком молочной железы при культивировании клеток в условиях нормального или пониженного содержания кислорода.

Методика исследования

Образцы подкожной жировой ткани получены при информированном согласии пациенток в ходе выполнения операций по удалению рака молочной железы (образцы № 3-7). Две пациентки (образцы № 6 и 7) в процессе предоперационного лечения прошли по 5 курсов лучевой и полихимиотерапии. Образцы подкожной жировой ткани от здоровых доноров (№ 1 и 2) были выделены из липоаспиратов сотрудниками “Покровского банка стволовых клеток человека” и предоставлены на 3-м пассаже.

Выделение МСК проводили согласно стандартному протоколу [30] с небольшими модификациями. Ткань промывали в ФСБ (“БиолоТ”), механически измельчали и инкубировали в 0.1% растворе коллагеназы I типа (“Sigma”). После центрифугирования и удаления жира суспензию фильтровали. Эритроциты лизировали с помощью 160 мМ водного раствора хлорида аммония. Ядросодержащие клетки осаждали центрифугированием, суспензировали в ростовой среде DMEM/F12 (“БиолоТ”) с 10% ЭТС (“HyClone”), 0.1 мг/мл стрептомицина и 100 ЕД/мл пенициллина G (“БиолоТ”) и переносили в вентилируемые культуральные флаконы (“Jet Biofilm”) по 1-4x10³ клеток/см². Клетки культивировали при 37°С в стандартных условиях (5% CO2 и 20% O2) в течение 24 ч. Затем флаконы инкубировали на орбитальном шейкере (65 об/мин); фракцию клеток, перешедших в суспензию, удаляли, а к клеткам, прочно прикрепленным к поверхности флакона, добавляли ростовую среду.

Клетки пересевали после образования 70-80% конфлюэнтного монослоя, используя раствор трипсинаверсена (“БиолоТ”). Количество клеток во взвеси определяли с помощью кондуктометрического счетчика Z1 Coulter Counter (“Beckman Coulter”). Клетки рассевали с плотностью 1-12x10³ клеток/см² во флаконы площадью 25 и 75 см². Среду во флаконах меняли каждые 34 сут.

Для изучения влияния пониженного содержания кислорода на ростовые и фенотипические характеристики МСК парные флаконы, содержащие одинаковое количество клеток одного пассажа, инкубировали в стандартных условиях (5% CO2 и 20% O2, нормоксия) или в условиях пониженного содержания кислорода (5% CO2 и 5% O2, гипоксия) в течение 2-12 нед.

Время удвоения численности популяций МСК (td) рассчитывали по формуле: td=ln2xN0/(dN/dt), где N0 — исходное количество клеток (посевная доза), dN — прирост числа клеток, dt — время (ч) от посева до снятия культуры [3].

Для анализа экспрессии антигенных маркеров клетки снимали с поверхности флаконов раствором трипсинаверсена, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 80g и инкубировали в растворе, содержавшем меченные флюорохромами моноклональные антитела (“Becton Dickinson”) или соответствующие изотипические контроли, в течение 30 мин при 4°С. Исследование проводили на проточном цитофлюориметре BD FACSCalibur (“Becton Dickinson”).

При изучении способности МСК к адипогенной дифференцировке к культурам, достигшим 70-80% конфлюэнтности, добавляли 0.2 мМ индометацина, 0.5 мМ дексаметазона и 1 мкМ изобутилметилксантина (“Sigma”). При смене среды каждые 3-4 сут использовали ростовую среду, содержавшую 10 мкМ инсулина (“Sigma”). Присутствие адипоцитов в культурах МСК выявляли через 3 нед окрашиванием жировым красным О (“BioOptica”). В качестве контроля использовали МСК тех же образцов и пассажей, культивированные в стандартной ростовой среде без добавления дифференцировочных стимулов.

Остеогенную дифференцировку МСК, достигших 70-80% конфлюэнтного монослоя, индуцировали, добавляя к ростовой среде 0.1 мкМ дексаметазона, 0.2 мМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты и 10 мМ глицерол-2-фосфата (“Chemicon”). Результаты оценивали через 2-3 нед по окрашиванию отложений кальция в остеоцитах ализариновым красным С (“Chemicon”). Контролем служили МСК тех же эксплантаций и пассажей, культивированные в стандартной ростовой среде.

Все эксперименты были поставлены в 3-6 повторностях. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы “Microsoft Excel”.

Результаты исследования

Культуры МСК здоровых доноров (образцы № 1 и 2) представляли собой активно пролиферирующие клетки с фибробластоподобной морфологией. Культуры МСК больных раком молочной железы (образцы № 3-5) обладали сходной морфологией. МСК, полученные от пациенток, прошедших предоперационную терапию (образцы №6 и 7), были крупнее, сильнее распластаны, имели много отростков и гетерогенную цитоплазму.

Рис. 1. Время удвоения МСК доноров (образцы № 1 и 2) и пациенток, не получавших лучевую и полихимиотерапию (образцы № 3 и 4), при культивировании в условиях нормоксии.

Время удвоения МСК от здоровых доноров (образцы № 1 и 2) на 4-м пассаже культивирования при нормоксии составляло 137 и 69 ч. При дальнейшем пассировании время удвоения сокращалось, достигая минимальных значений на 6-м и 7-м пассажах. Начиная с 7-8-го пассажа этот показатель увеличивался (рис. 1, а). По ростовым характеристикам МСК пациенток, не получавших лучевую и полихимиотерапию (образцы № 3-5), практически не отличались от клеток здоровых доноров. Их интенсивная пролиферация начиналась после 3-го пересева, время удвоения достигало минимальных значений на 4-м и 5-м пассажах (рис. 1, б). При длительном пассировании происходило постепенное замедление роста всех клеточных культур МСК здоровых доноров и пациенток, не получавших лучевую и полихимиотерапию (рис. 2).

Ростовые характеристики клеток пациенток, прошедших предоперационную терапию (образцы № 6 и 7), существенно отличались. Среднее время удвоения МСК в этих культурах на 2-м пассаже варьировало от 299 до 592 ч. Клетки полностью прекращали пролиферацию после 2-4-го пересева.

Таким образом, при пассировании МСК здоровых доноров и пациенток, не получавших предоперационную терапию, были выявлены сходные закономерности. Пролиферативный потенциал МСК пациенток, прошедших курсы лучевой и полихимиотерапии, был необратимо нарушен.

Культивирование МСК здоровых доноров в условиях гипоксии стимулировало пролиферацию и уменьшало время удвоения популяции. При этом сохранялась описанная выше закономерность: в течение первых 5 пассажей время удвоения снижалось, а при дальнейшем пассировании увеличивалось (рис. 3, а).

Условия гипоксии также стимулировали пролиферацию МСК, выделенных из жировой ткани пациенток, не получавших предоперационную терапию. Время удвоения клеточных популяций уменьшалось к 3-5-му пассажам, после чего возрастало (рис. 3, б, в). На всех пассажах время удвоения МСК при гипоксии было меньше, чем при нормоксии.

При культивировании МСК пациенток, перенесших лучевую и полихимиотерапию, изменение состава газовой среды приводило не только к значительному сокращению времени удвоения популяции, но также позволяло продлить период культивирования. Так, образцы МСК № 7, которые в условиях нормоксии прекращали пролиферацию после 2-го пассажа, при гипоксии пролиферировали до 4-го пассажа включительно (рис. 3, г).

Рис. 2. Изменение времени удвоения МСК (образец № 3) при длительном культивировании в условиях нормоксии.

Таким образом, культивирование МСК всех исследованных образцов в условиях гипоксии приводило к увеличению пролиферативной активности. Эти результаты согласуются с данными, полученными при исследовании МСК, выделенных из жировой ткани или из костного мозга [1,2,10,14]. Для индивидуальных образцов МСК стимулирующий эффект культивирования при гипоксии был выражен в разной степени. Гипоксические условия позволили продлить период выживания и пролиферации культур МСК пациенток, получивших до операции комбинированное лечение.

Поверхностные антигены исследовали на клетках, выделенных из жировой ткани доноров и пациенток, не получавших предоперационную терапию. Были использованы МСК после 3-4 пассажей культивирования в условиях нормоксии или гипоксии. Для изучения влияния длительного культивирования (до 11-го пассажа) на фенотип использовали образцы МСК № 1 и 3.

Рис. 3. Время удвоения МСК при культивировании образца № 1 от условно здорового донора (а), образцов № 3 (б) и 4 (в) от пациенток, не получавших комбинированную терапию, и образца № 7 от пациентки после лучевой и полихимиотерапии (г).

При культивировании в условиях нормоксии клетки всех исследованных образцов экспрессировали характерные для МСК маркеры: CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 и CD105 (таблица). Доля клеток, несущих антигены CD29, CD44, CD73, CD90 и CD166, в разных образцах МСК различалась незначительно, что согласуется с результатами других исследователей [1,2,16,18,28]. Доля клеток, экспрессирующих антиген CD105, в разных образцах МСК также различалась, но во всех случаях превышала 75%. Все образцы МСК содержали клетки, несущие поверхностные антигены CD10 и CD54; доля этих клеток составляла 51-96% для CD10 и 74-98% для CD54. Связь между снижением уровня экспрессии этих маркеров и принадлежностью соответствующей клеточной линии донорам или пациенткам со злокачественными новообразованиями не выявлена. Экспрессия поверхностных антигенов в образцах МСК № 3 представлена на рисунке 4.

На МСК всех исследованных образцов не была выявлена экспрессия антигена MHC II класса — HLA-DR, маркера гемопоэтических клеток предшественников CD45, а также антигенов, характерных для эндотелиальных клеток (CD31 и CD62E).

В ряде работ показано, что на ранних пассажах в культурах МСК выявляется фракция CD34+ - клеток [27,29,31]. В нашем исследовании эта фракция во всех образцах МСК составляла не более 2%, что можно объяснить использованием стандартизованного метода отделения неприлипающих и слабо прилипающих клеток по истечении первых суток после эксплантации. Удаление таких клеток с помощью инкубации на шейкере позволяет использовать фракцию клеток, наиболее активно прикрепляющихся к пластику.

При длительном пассировании МСК стабильно экспрессировали поверхностные антигены CD29, CD44, CD90 и CD105. Количество клеток, несущих антигены CD73 и CD166, менялось, однако полученные данные не позволили выявить каких-либо закономерностей. Количество клеток, несущих на своей поверхности антиген CD10, уменьшалось в процессе культивирования от 2-го до 11-го пассажей.

При культивировании МСК в условиях гипоксии доля клеток, экспрессирующих антигены CD29, CD44, CD73, CD90 и CD166, была наиболее стабильной (таблица). Доля клеток, несущих маркеры CD10, CD54 и CD105, различалась в индивидуальных образцах. Было отмечено снижение интенсивности флюоресценции клеток при выявлении антигенов CD29, CD44, CD90, CD166, CD10 и CD105 по сравнению с культивированием в условиях нормоксии (рис. 4). Это явление может отражать уменьшение плотности антигенов на МСК, возникающее вследствие усиления пролиферации клеток при культивировании в условиях гипоксии. Ни в одном из образцов МСК экспрессия антигенов CD31, CD45, CD62E и HLA-DR не выявлена.

Иммунофенотип поверхностных антигенов МСК на 34м пассажах культивирования при нормоксии (Н) или гипоксии (Г) Антиген Доля клеток, экспрессирующих антигены, в образцах МСК, % образец № 1 образец № 2 образец № 3 образец № 4 образец № 5 Н Г Н Г Н Г Н Г Н Г CD29 90.5 97.6 97.0 98.2 96.4 99.4 98.5 96.4 95.0 96.5 CD44 88.9 96.5 96.3 97.7 94.8 99.0 92.3 98.3 91.6 95.4 CD73 93.8 — 96.4 98.0 96.1 97.7 94.6 — 95.4 98.8 CD90 96.0 99.2 98.1 99.2 98.3 99.3 99.4 99.5 99.0 98.4 CD166 86.7 90.8 95.8 93.9 95.7 99.0 92.7 94.9 98.0 92.7 CD105 75.1 72.5 94.9 97.2 94.0 98.7 86.1 85.8 94.8 83.4 CD10 79.8 66.0 60.7 77.5 89.5 72.5 95.6 91.9 51.1 57.7 CD54 — — 74.5 80.5 78.6 82.4 — — 97.7 98.5 CD31 0 0 0 0 0 0 0 0.1 0 0 CD34 1.0 1.2 1.1 3.7 1.9 3.6 1.2 2.8 0.3 0.5 CD45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.1 CD62E 0.1 0.1 0 0 0 0 0.1 0.6 0 0.1 HLA-DR 0.2 0 0 0 0 0 0.1 0.5 0.6 0

В целом полученные результаты позволяют заключить, что антигены CD29, CD44, CD90 и CD166 стабильно представлены на МСК от разных индивидов вне зависимости от условий культивирования и продолжительности пассирования. Экспрессия этих молекул, вероятно, в большей степени отражает природу МСК, чем их функциональное состояние. Экспрессия антигенов CD105 и CD73, которые также являются основными маркерами МСК, варьирует в образцах клеток от разных индивидов и в процессе пассирования. Антиген CD10 оказался наименее стабильным из всех исследованных маркеров.

При исследовании способности МСК к дифференцировке через 8 сут после добавления в среду адипогенных стимулов в культурах появлялись клетки, содержащие липидные включения. После 3 нед культивирования такие клетки присутствовали во всех исследованных образцах (рис. 5). При культивировании в условиях гипоксии доля адипоцитов через 3 нед составляла 50% популяции, в то время как при нормоксии — 20%. Различия в способности к адипогенной дифференцировке между клетками здоровых доноров и пациенток не выявлены. В среде без адипогенных стимулов спонтанной дифференцировки МСК в адипоциты не происходило вне зависимости от состава газовой фазы.

Рис. 4. Цитофлюориметрический анализ экспрессии антигенов на поверхности образца МСК № 3, культивированного в условиях нормоксии (толстые линии) или гипоксии (пунктирные линии). Сплошная тонкая линия — изотипические контроли. По оси абсцисс — интенсивность флюоресценции (отн. ед.), по оси ординат — число событий.

Рис. 5. Липидные включения в образце МСК № 3 после 3 нед культивирования в условиях гипоксии (а) и нормоксии (б) в среде, содержавшей адипогенные стимулы. Окрашивание жировым красным О.

При культивировании МСК в условиях нормоксии в среде, содержавшей факторы индукции остеогенной дифференцировки, после 11-х суток клетки начинали формировать минерализированный матрикс, количество которого постоянно увеличивалось. После 3 нед культивирования матрикс занимал около 50% культуральной поверхности (рис. 6). Различий в способности к остеогенной дифференцировке между МСК здоровых доноров и пациенток не выявлено. При отсутствии остеогенных стимулов спонтанного формирования минерализованного матрикса не происходило.

Рис. 6. Минерализованный матрикс в культуре образца МСК № 4 после 3 нед культивирования в среде, содержавшей индукторы остеогенной дифференцировки. Окрашивание ализариновым красным С.

Полученные результаты указывают на то, что МСК больных раком молочной железы, как и клетки здоровых людей, способны к адипогенной и остеогенной дифференцировке. При этом пониженное содержание кислорода в газовой среде ускоряет процесс дифференцировки в адипоциты.

Проведенное исследование позволило охарактеризовать МСК, полученные от пациенток с опухолью молочной железы. Клетки пациенток, не получавших лучевую и полихимиотерапию, соответствуют критериям, определяющим принадлежность культивируемых клеток к категории МСК. В то же время установлено, что пролиферативная способность МСК пациенток, прошедших курсы лучевой и полихимиотерапии, необратимо нарушается.

Работа выполнена по плану НИР при поддержке Минздрава РФ (ГК № 012012255679), с использованием оборудования Центра коллективного пользования “Биотехнологический центр исследования экспрессии генома” ФГБУ “Российский научный центр радиологии и хирургических технологий” и средств ООО “Полигност”.

Литература

1. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. // Цитология. 2009. Т. 51, № 1. С. 5-11.
2. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Рылова Ю.В. // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения. М., 2009. С. 125-145.
3. Гриффитс Б. // Культура животных клеток. Методы. М., 1989. С. 56-107.
4. André V., Longoni D., Bresolin S. et al. // Blood Cancer J. 2012. Vol. 2. P. e94. doi:10.10381/bcj.2012.40.
5. Campioni D., Moretti S., Ferrari L. et al. // Haematologica. 2006. Vol. 91, N 3. P. 364-368.
6. Carothers A.M., Rizvi H., Hasson R.M. et al. // Cancer Res. 2012. Vol. 72, N 1. P. 346-355.
7. Chernykh E.R., Shevela E.Y., Leplina O.Y. et al. // Bull. Exp. Biol. Med. 2006. Vol. 141, N 1. P. 117-120.
8. De Ugarte D.A., Alfonso Z., Zuk P.A. et al. // Immunol. Lett. 2003. Vol. 89, N 23. P. 267-270.
9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. // Cytotherapy. 2006. Vol. 8, N 4. P. 315-317.
10. Fehrer С., Brunauer R., Laschober G. et al. // Aging Cell. 2007. Vol. 6, N 6. P. 745-757.
11. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R. et al. // J. Cell. Physiol. 2006. Vol. 207, N 2. P. 331-339.
12. Griffin M.D., Ritter T., Mahon B.P. // Hum. Gene Ther. 2010. Vol. 21, N 12. P. 1641-1655.
13. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A. et al. // J. Cell. Physiol. 2001. Vol. 189, N 1. P. 54-63.
14. Guilak F., Lott K.E., Awad H.A. et al. // J. Cell. Physiol. 2006. Vol. 206, N 1. P. 229-237.
15. Hu J., Zhou Z., Shi S. et al. // Oncol. Lett. 2013. Vol. 5, N 1. P. 179-184.
16. Lee R.H., Kim B., Choi I. et al. // Cell. Physiol. Biochem. 2004. Vol. 14, N 46. P. 311-324.
17. Malladi P., Xu Y., Chiou M. et al. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290, N 4. P. C1139-C1146.
18. Mitchell J.B., McIntosh K., Zvonic S. et al. // Stem Cells. 2006. Vol. 24, N 2. P. 376-385.
19. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. // Science. 1999. Vol. 284. P. 143-147.
20. Ren H., Cao Y., Zhao Q. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. Vol. 347, N 1. P. 12-21.
21. Rigotti G., Marchi A., Galie M. et al. // Plast. Reconstr. Surg. 2007. Vol. 119, N 5. P. 1409-1422.
22. Shi M., Liu Z.W., Wang F.S. // Clin. Exp. Immunol. 2011. Vol. 164, N 1. P. 18.
23. Strem B.M., Hicok K.C., Zhu M. et al. // Keio J. Med. 2005. Vol. 54, N 3. P. 132-141.
24. Tsai C.C., Chen Y.J., Yew T.L. et al. // Blood. 2011. Vol. 117, N 2. P. 459-469.
25. Uccelli A., Moretta L., Pistoia V. // Eur. J. Immunol. 2006. Vol. 36, N 10. P. 2566-2573.
26. Varga G., Kiss J., Varkonyi J. et al. // Pathol. Oncol. Res. 2007. Vol. 13, N 4. P. 311-319.
27. Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D. et al. // J. Cell. Physiol. 2006. Vol. 208, N 1. P. 64-76.
28. Zannettino A.C., Paton S., Arthur A. et al. // J. Cell. Physiol. 2008. Vol. 214, N 2. P. 413-421.
29. Zhu Y., Liu T., Song K. et al. // Cell Biochem. Funct. 2008. Vol. 26, N 6. P. 664-675.
30. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. // Tissue Engin. 2001. Vol. 7, N 2. P. 211-228.
31. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. // Mol. Biol. Cell. 2002. Vol. 13, N 12. P. 4279-4295.

А.А.Пиневич, М.П.Самойлович, О.А.Шашкова, Н.Л.Вартанян, В.Н.Полысалов, Л.Н.Киселева, А.В.Карташев, А.А.Айзенштадт, В.Б.Климович