3.8.1 Определение теста на лекарственную чувствительность к птп
Существуют 2 метода определения теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) к ПТП:
метод абсолютной концентрации
3.8.1.1 Метод абсолютных концентраций на плотных средах для определения чувствительности к птп первого ряда
В соответствии с критериями устойчивости в опытах по её изучению рекомендуется пользоваться следующими концентрациями туберкулостатических препаратов:
Используемые концентрации антибактериальных препаратов 1 линии:
Изониазид 1; 5 мкг/мл
Рифампицин 40 мкг/мл
Этамбутол 2; 5 мкг/мл
Стрептомицин 5; 10 мкг/мл
Таблица 5 - Критерии устойчивости микобактерий туберкулёза к ПТП
Микобактерий, устойчивые при росте на среде, содержащей препарат в концентрации (в мкг/мл)
1. Изониазид 2. Рифампицин З.Этамбутол 4. Стрептомицин
Таблица 6 - Активность чистых лекарств
( мкг активной субстанции на мг веса продукта)
мкг активной субстанции на 1 мг
Активность лекарства варьирует от одной партии/серии лекарств к другой. Эти важные сведения обычно приводятся на этикетках контейнеров лекарств, упаковках или их можно получить от компании-изготовителя.
3.8.1.2 Метод пропорций на плотных средах для определения чувствительности к основным птп
Метод пропорций широко используется в мире. Для выполнения этого метода используется среда Левенштейна-Йенсена (Л-Й), и устойчивость тестируемых штаммов определяется отношением числа колоний выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств.
Этот показатель позволяет определить наличие устойчивых мутантов в общей популяции жизнеспособных колониеобразующих единиц. Для получения подсчитываемого числа колоний, выросших на среде Л-Й, рекомендуется посев 2 разведений. Преимущество данного метода в том, что в исследовании используется стандартный инокулят и можно подсчитать число колоний, выросших на Л-Й.
Приготовление питательной среды с лекарствами
Большую важность для получения точных результатов ТЛЧ представляет приготовление среды, содержащей лекарственный препарат. Ниже приведены критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й: Изониазид 0,2 мкг/мл Стрептомицин 4 мкг/мл Рифампицин 40 мкг/мл Этамбутол 2 мкг/мл
При приготовлении среды с препаратами необходимо учитывать активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой и в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются компанией-изготовителем.
Содержание активного вещества 1000 мкг/мл
1) Приготовление растворов лекарственных препаратов:
20 мг изониазида растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл
1 мл приготовленного раствора (2000мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллиро ванной воды; полученный раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл
1 мл раствора (200 мкг/мл) растворить в 9 мл дистиллированной воды - полу ченный рабочий раствор имеет концентрацию 20 мкг/мл
2 мл рабочего раствора (20 мкг/мл) добавить к 200 мл среды Л-Й
Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин.
Стрептомицин:
Содержание активного вещества 780 - 800 мкг/мг
Процедура приготовления среды с 4 мкг/мл (чистое вещество 780мкг/мг)
Приготовление раствора лекарственного препарата: 5,1 мг S растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 400 мкг/мл
2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й
Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин
Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл
Приготовление раствора лекарственного препарата: 40 мг R растворить в 10 мл пропиленгликоля, встряхивая на водяной бане при 700С - полученный раствор име ет концентрацию 400 мкг/мл
2 мл полученного раствора добавить к 200 мл среды Л-Й
Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин
Содержание активного вещества 1,000 мкг/мл Приготовление раствора лекарственного препарата:
20 мг Е растворить в 10 мл дистиллированной воды - полученный раствор имеет концентрацию 2000 мкг/мл
Добавить 1 мл полученного раствора (2000 мкг/мл) к 9 мл дистиллированной воды - полученный рабочий раствор имеет концентрацию 200 мкг/мл
2 мл рабочего раствор добавить к 200 мл среды Л-Й
Питательную среду с лекарственным препаратом разлить в пробирки по 6 мл
Свертывание среды проводится при 900 С в течение 50 мин
Приготовление бактериальной суспензии
Выросшую культуру микобактерий снимают с питательной среды Л-Й с помощью металлической петли и помещают в пробирку с 5-6 стеклянными бусами. При использовании металлической петли в пробирку внести предварительно 2 капли стерильной дистиллированной воды. Пробирку с бактериальной массой гомогенизируют в течение 1-2 минут на встряхивателе "Vortex", затем добавляют 7 мл дистиллированной воды и снова осторожно встряхивают до образования однородного раствора
Полученную суспензию оставляют на 1-3 минуты до осаждения крупных частиц. Затем гомогенную взвесь (верхнюю часть суспензии) собирают и переносят в сте-
рильную пробирку. Мутность гомогенной взвеси сравнивают со стандартом Мак-Фар ланда №1, постепенно добавляя дистиллированную воду до тех пор, пока густота взвеси не сравняется с густотой стандарта. Полученная суспензия называется
В дальнейшем из рабочей суспензии готовятся последовательные десятикратные разведения: 10-1; 10-2; 10-3; и 10-4
тля каждой суспензии используются разные 1мл градуированные пипетки).
Посев бактериальной суспензии:
в 2 пробирки со средой Л-Й без лекарств (контрольная пробирка) делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 , 10-4 и распределяют по всей поверхности среды.
в 2 пробирки со средой Л-Й, содержащей каждое лекарство делают посев 0,1 мл суспензии разведенной до 10-2 и распределяют по всей поверхности сре ды.
Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 С, до появления видимого роста на среде без лекарств, после чего в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.
Интерпретация результатов
Критерием устойчивости является 1 % роста бактериальной популяции для всех этих препаратов. Через 4 недели инкубации, рост на среде, не содержащей лекарства, ;шокулированной из суспензии 10-4 сравнивают с ростом на среде с препаратом, ;гнокулированной из суспензии 10-2. Если число колоний больше на среде, содержа-шей лекарство, тестируемый штамм считается устойчивым.
Так как отношение 10-2 и 10-4 является как 1:100, то следующая формула может использоваться для подсчета % устойчивости:
Число колоний на среде с лекарствами в разведении 1Q- 2 = % устойчивости Число колоний на среде без лекарств в разведении 10-4
Если рост бактерий на питательной среде, содержащей лекарство, превышает 1%, штамм считается устойчивым.