ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ITS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МОЛОЧАЕВ И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА ПЕРВИЧНУЮ СТРУКТУРУ Крюков А.А.

В работе приведен анализ вторичной структуры ITS-последовательностей видов подрода Esula рода Euphorbia. Отмечено влияние вторичной структуры на первичную и наоборот. Анализу были подвергнуты порядка сотни последовательностей. Приведена универсальная консервативная структура ITS2. На вторичных структурах отмечены вставки и делеции, сделаны выводы об их происхождении.

Молекулы РНК обладают способностью в физиологических условиях образовывать внутримолекулярные спиральные двунитевые антипараллельные комплексы (вторичную структуру), в которых пуриновые и пиримидиновые комплексы образуют связанные водородными связями пары A-U, G-C и U-G. В тоже время ITS-последовательности рРНК являются важными генетическими маркерами для идентификации организмов до вида. Поэтому очень важно понимать, как влияет вторичная структура ITS на первичную последовательность и наоборот. По всей видимости, вторичная структура ITS имеет значение для процессинга пре-рРНК, поскольку, несмотря на сравнительно высокий темп изменений в нуклеотидной последовательности этих районов рРНК, вторичная структура спейсеров очень консервативна даже у эволюционно далеких систематических групп. Складывается впечатление, что вторичные структуры ITS поддерживаются жестким стабилизирующим отбором [3]. Для анализа вторичных структур, которые могут формироваться рРНК межгенными спейсерами, разработаны различные программы, определяющие возможную укладку молекул РНК и отбирающих те из конфигураций возможных вторичных структур, которые обладают наименьшей свободной энергией. Многие авторы отмечают, что разные программы, определяющие укладку молекул РНК по принципу конфигурации с минимальной свободной энергией, могут давать сильно различающиеся результаты для одной и той же последовательности [7]. При этом показано, что экспериментально определенная структура многих РНК не характеризуется минимально возможным для этой последовательности уровнем свободной энергии [3]. Целью работы является - построить вторичные структуры ITS молочаев и изучить их консервативные мотивы. Материал и методы В работе было использовано чуть более 100 последовательностей региона ITS1-5.8SrRNA-ITS2 молочаев. 56 из них были получены нами, остальные последовательности взяты из базы данных Генбанк. ДНК была выделена по CTAB протоколу [1]. В качестве прямых праймеров, комплементарных участку гена 18S рРНК, использовались олигонуклеотиды ITS5 - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG [6] или ITS1P - AACCTTATCATTTAGAGGAAGG [5]. В качестве обратного праймера во всех случаях использовался олигонуклеотид ITS4 - TCCTCCGCTTATTGATATGC [6], комплементарный участку гена 26S рРНК. Выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось вручную с помощью пакета программ MEGA 5.01. Возможные вторичные структуры РНК рассчитывали с помощью программы RNA Structure v. 4.5 [4], работающей на основе алгоритма Цукера [7]. Результаты и обсуждение Исследована первичная структура ITS последовательностей молочаев. Длина ITS1 у рассмотренных нами видов варьирует от 202 пар нуклеотидов (у Euphorbia exigua) до 267 пар нуклеотидов (у E. condylocarpa) при общей длине выравнивания в 300 оснований. Такая высокая вариабельность последовательностей ITS1 у видов подрода Esula обусловлена большим количеством вставок и делеций. Самая крупная делеция представлена у E. exigua - 49 пар нуклеотидов с 110 по 176 позиции выравнивания. Встречаются вставки до 7-8 нуклеотидов (в обоих ITS) и можно предположить, что такие вставки обнаруживаются обычно на концах шпилек вторичной структуры ITS или между шпильками. Обычно эти вставки являются треками poly-A. Содержание G+C в ITS1 изучаемых последовательностей варьирует от 51,6 % у E. pekinensis до 70,4 % у E. lathyris. Неравномерность GC-содержания как в последовательностях отдельных генов, так и во всем геноме - это важный параметр, характеризующий эволюцию таксона. GC-обогащенные участки являются потенциальными мишенями для метилаз, а метилирование цитозина регулирует работу генов [2]. Кроме того, повышенное содержание G-C стабилизирует вторичную структуру РНК-транскрипта ITS вследствие того, что пара G-С имеет три водородные связи, а не две, как пара A-T. Длина ITS2 у рассмотренных видов варьирует от 211 пар нуклеотидов (у E. antiquorum) до 235 пар (E. trichotoma) при общей длине выравнивания в 253 пары оснований. Сразу заметим, что в ITS2 реже наблюдаются крупные делеции и вставки. Если посмотреть значения G+C для всех образцов по ITS2, то увидим, что они варьируют от 55,6% у E. procera до 76,2% у E. lathyris. В данном случае видно, что содержание G+C в ITS2 выше, чем в ITS1; учитывая вышесказанное о стабилизации структуры парами G-C, следует полагать, что этот факт является свидетельством того, что ITS2 может иметь более стабильную вторичную структуру. В результате работы определена вторичная структура исследуемых последовательностей (рис. 1-3). Линиями и стрелками указаны районы делеций и вставок для различных видов молочаев. Вторичные структуры ITS1 для неродственных организмов могут различаться, но, как правило, являются схожими для близких видов. В отличие от ITS1, для ITS2 известна универсальная вторичная структура - она представлена 4 шпильками и межшпилечными участками (рис. 2). На рисунке 3 показано, что вставки треков poly-A попадают на концы шпилек. Не такие очевидные вставки можно найти и на рисунках 1-2. Рис. 1. Вторичная структура ITS1 E. borealis. Жирными линиями показаны участки делеций для видов, у которых они присутствуют, стрелкой показано место вставки трека poly-A Рис. 2. Вторичная структура ITS2 E. helioscopia. Жирной линией показан участок делеций (для других видов) Рис. 3. Первая шпилька ITS2 E. heteradena. Жирной линией показана вставка Заключение Исходя из наблюдений, можно предположить, что вставки могут происходить на концах шпилек и между шпильками вторичной структуры (важно, чтобы последовательность не была спарена с другими нуклеотидами во вторичной структуре), а делеции - это результат обрезания или укорачивания шпилек.