Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Шамшурина, Екатерина Валерьевна

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шамшурина, Екатерина Валерьевна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2. 1. Классификация зоолектинов.

2.2. Функции лектинов.

2.3. Участие лектинов в процессах морфогенеза.

2. 4. Маннан-связывающие лектины.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.2. Приготовление цел омической жидкости.

3. 3. Реакция прямой гемагглютинации (РПГА).

3. 4. Ингибирование РПГА.

3. 5. Определение зависимости активности МСЛ-БМ от температуры.

3. 6. Определение зависимости активности МСЛ-БК от рН.

3. 7. Определение зависимости активности МСЛ-8Ы от концентрации ионов Са2+ вереде.

3. 8. Выделение МСЛ-БИ.

3. 8. 1. Ионообменная хроматография.

3. 8. 2. Аффинная хроматография.

3. 8. 3. Гельфильтрация.

3. 9. Получение антисыворотки и АТ(МСЛ-81чГ).

3. 10. Получение конъюгатов АТ(МСЛ-8М) с Б1ТС.

3. 11. ДСН-ПААГ-электрофорез.

3. 12. Вестерн-блот анализ МСЛ-БЫ.

3.13. Установление первичной структуры МСЛ-8К.

3. 13. 1. Выделение РНК и синтез кДНК.

3. 13.2. Клонирование и секвенирование кДНК.

3. 14. Иммуноцитохимическое выявление МСЛ-БЫ в личинках и тканях 51. пис1ш.

3. 14. 1. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей

3. 14. 2. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание мазков целомоцитов S. nudus.

3. 14. 3. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание полутонких и ультратонких срезов.

3. 14. 4. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание гистологических срезов и прижизненное прямое иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов и личинок S. nudus.

3. 15. Исследование влияния MCJI-SN на фагоцитарную активность целомоцитов S. nudus в условиях in vitro.

3.16. Исследование влияния MCJI-SN на ранний онтогенез морского ежа S. nudus.

4. 1. Выделение MCJI-SN из целомической жидкости S. nudus.

4.2. Определение молекулярной массы и субъединичного состава

4. 3. Углеводная специфичность MCJI-SN.

4. 4. Зависимость активности MCJI-SN от концентрации ионов Са , рН и температуры.

4. 5. Установление первичной структуры MCJI-SN.

4. 6. Локализация МСЛ-SN в тканях S. nudus.

4. 7. Влияние МСЛ-SN на фагоцитарную активность целомоцитов S.nudus in vitro.

4. 8. Электрофоретическое выявление МСЛ-SN в эмбрионах и личинках

4. 9. Локализация МСЛ-SN в личинках S. nudus.

4. 10. Влияние МСЛ-SN и его лигандов на ранний онтогенез морского ежа

5. 1. Физико-химические свойства МСЛ-БЫ.

5. 2. Аминокислотная последовательность и предсказанная пространственная структура молекулы МСЛ-8М.

5.3. Локализация МСЛ-8К в органах и тканях 5. пис1ш.

5. 4. Участие МСЛ-БЫ в защитных реакциях.

5. 5. Участие МСЛ-81ЧГ в раннем онтогенезе & писких.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология», 03.03.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus»

Лектины — это обширный класс белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры (Королев, 1984). На данный момент лектины обнаружены у организмов, находящихся на разных ступенях эволюции, начиная от наиболее примитивных форм жизни -вирусов и бактерий — до представителей высших позвоночных, что свидетельствует об эволюционной древности и универсальности механизмов, основанных на белок-углеводном распознавании. Известно, что лектины принимают участие во многих биологических процессах, таких как — оплодотворение, развитие, миграция клеток, апоптоз и т.д., а биологическая значимость лектинов определяется значимостью их лигандов - углеводов (N1, Т1гагс1, 1996). Важную роль играют лектины в реакциях конститутивного или врожденного иммунитета. Являясь составной частью иммунитета позвоночных, лектины осуществляют немедленную, в отличие от системы адаптивного иммунитета, реакцию на инфекцию или повреждение. Наиболее изученными лектинами, выполняющими барьерную функцию, являются лектины С-типа, и, в частности, маннан-связывающие лектины (МСЛ), относящиеся к коллектинам. Исследована структура молекулы МСЛ и установлено наличие в ней консервативного участка, ответственного за связывание с углеводами (углевод-распознающего домена) и эффекторного коллагеноподобного домена. Установлено, что МСЛ в комплексе с сериновыми протеазами участвуют в активации системы комплемента по лектиновому пути (ТЬеа1 а1., 1997), активизируют фагоцитоз, выступая в роли опсонинов (КиЫтап е1 а1., 1989).

У представителей беспозвоночных животных структура и функции МСЛ исследованы значительно меньше, чем у позвоночных, несмотря на то, что данные лектины обнаружены как у первичноротых (коралловые полипы, моллюски, ракообразные, насекомые), так и у вторичноротых животных (иглокожие, низшие хордовые - асцидии, ланцетник). Вместе с тем, МСЛ

часть древней системы защиты, составляющей основу неспецифического иммунитета беспозвоночных и послужившей предшественником сложного иммунитета позвоночных животных. Поэтому, исследование системы неспецифического иммунитета беспозвоночных, в частности MCJI, имеет большое значение для понимания процесса формирования и становления функций этого компонента защитной системы в эволюции Metazoa. Для развития эволюционных представлений актуальны исследования, выполненные на иглокожих - примитивных, близких к предковым формам, представителях вторичноротых животных. Иглокожие являются классическим экспериментальным объектом для работ в области биологии развития и сравнительной иммунологии. Ранее у двух представителей голотурий — Cucumaria japónica и Apostichopus japonicus — были обнаружены и охарактеризованы MCJI, гомологичные MCJI позвоночных (Булгаков и др., 2000; Bulgakov et al., 2007). Исследована биологическая активность этих лектинов, их роль в иммунной защите. Кроме того, показано, что MCJI А. japonicus задействованы в процессе регенерации пищеварительного тракта после его эвисцерации, что является доказательством интегративной функции иммунной системы и участия ее компонентов в процессах поддержания структурного гомеостаза организма. В серии предварительных исследований показано наличие лектинной активности целомической жидкости морского ежа Strongylocentrotus nudus по отношению к маннанам -полисахаридам, построенным из остатков маннозы.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось исследование структуры, физико-химических свойств, роли в защитных реакциях и эмбриогенезе нового лектина, выделенного из целомической жидкости морского ежа S. nudus (MCJI-SN) — вероятного гомолога маннан-связывающих лектинов позвоночных. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить основные физико-химические свойства MCJI-SN;

2. Определить аминокислотную последовательность молекулы MCJI-SN;

3. Установить локализацию в организме морского ежа и возможные места биосинтеза MCJI-SN;

4. Исследовать роль MCJI-SN в защитных реакциях и в эмбриогенезе морского ежа S. nudus.

Научная новизна. Из целомической жидкости морского ежа S. nudus выделен и всесторонне охарактеризован новый лектин. Установлена его тонкая углеводная специфичность, определены основные физико-химические свойства и аминокислотная последовательность молекулы. На основании полученных данных лектин был отнесен к маннан-связывающим лектинам С-типа. Установлено наличие в организме морского ежа двух иммунохимически идентичных форм лектина: растворенной в целомической жидкости и связанной, входящей в состав компонентов внеклеточного матрикса. Определены вероятные источники биосинтеза MCJI-SN. Показан широкий спектр биологической активности MCJI-SN: являясь компонентом неспецифического иммунитета и выступая в роли опсонина, лектин задействован в процессе эмбрионального развития, способствуя миграции клеток первичной мезенхимы.

Личный вклад. Материал, положенный в основу диссертационной работы, в основном, получен, обработан и проанализирован автором самостоятельно. Выделение и определение свойств МСЛ-SN было выполнено под руководством ст.н.с., к.х.н. A.A. Булгакова и н.с., к.б.н. И.Ю. Петровой. Установление аминокислотной последовательности лектина было проведено совместно с н.с., к.б.н. С.Н. Ковальчук. Основная часть работ по проведению иммуноцитохимических и электронно-микроскопических исследований, а также по установлению функций МСЛ-SN в организме морского ежа выполнена при непосредственном участии автора.

Теоретическое и практическое значение работы. У представителя иглокожих обнаружен МСЛ-SN, выполняющий защитную функцию и гомологичный МСЛ позвоночных животных, что доказывает эволюционную преемственность этого компонента неспецифического иммунитета в ряду вторичноротых. Полученные данные вносят существенный вклад в теорию происхождения системы комплемента - одного из основных механизмов защиты позвоночных. Установлено участие МСЛ иглокожих в процессах эмбриогенеза и показана интегративная роль этого компонента врожденного иммунитета. Практическое значение результатов работы связано с возможностью применения нового лектина, функционально и структурно охарактеризованного, обладающего уникальной углеводной специфичностью, в биомедицинских исследованиях.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на симпозиуме с международном участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Россия, Москва, 2007), на XI Международной молодежной конференция по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2007), на XII Всероссийской школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии (ТИБОХ ДВО РАН, МЭС, 2009) и на годичных конференциях ИБМ ДВО РАН (2008-2010)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, выводов и списка литературы (167 источников, из которых 157 на английском языке). Работа изложена на 103 страницах, из них 61 машинописного текста, 24 илюстрации (2 таблицы, 14 микрофотографий, 1 электроннограмма, 7 графиков).

Финансовая поддержка. Работа проведена при финансовой поддержке ДВО РАН (проекты № 09-Ш-А-06-198 и Ю-П-В-06-088) и РФФИ (проекты № 07-04-01247-а и 09-04-98535-рвостока).