Стабилизирующее действие на мембраны тучных клеток травы череды трехраздельной и травы череды олиственной Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Корожан Н. В., Бузук Г. Н.

Цель изучить противоаллергическую активность настоев и настоек травы череды трехраздельной и травы череды олиственной на модели стабилизации мембран тучных клеток in vitro. Исследование проводили на трех группах беспородных мышей-самцов, по 5 особей в каждой. Для сенсибилизации использовали аллерген эпидермальный из шерсти кошки, для окраски выделенных тучных клеток 0,1% раствор толуидинового синего, в качестве препарата сравнения 5 мг/мл раствор натрия кромогликата . Стабилизирующее действие настоев и настоек травы видов череды на мембраны тучных клеток носило дозозависимый характер. Наибольшее снижение количества дегранулированных тучных клеток c 19-22% отмечалось при добавлении настоев и настоек в дозе 10 мг/мл среды (до 5-10%). Снижение дозы приводило к уменьшению выраженности стабилизирующего действия на мембраны тучных клеток. Во всех случаях количество дегранулированных тучных клеток статистически значимо (р<0,05) отличалось от такового в контроле с аллергеном для сенсибилизированной группы. При этом рассчитанные значения ЕД50 для исследуемых средств статистически значимо не различались ни для различных лекарственных форм на основе конкретного вида сырья, ни для одинаковых лекарственных форм на основе разных видов сырья. Статистически значимых отличий в стабилизирующем действии настоев и настоек травы видов череды в дозе 10 мг/мл и раствора натрия кромогликата не выявлено (р<0,05). Компоненты настоев и настоек травы череды трехраздельной и череды олиственной не обладали способностью вызывать анафилактоидную реакцию в исследуемых дозах. Таким образом, настои и настойки исследуемых видов череды оказывали выраженное стабилизирующее действие на мембраны тучных клеток in vitro. Исходя из полученных данных, трава череды олиственной может быть рекомендована как противоаллергическое средство наряду с травой череды трехраздельной. Выбор лекарственной формы из указанного сырья обосновывается лишь удобством ее применения.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Корожан Н. В., Бузук Г. Н.

The aim of this research was to study antiallergic activity of Bidens tripartita and Bidens frondosa herbs infusions and tinctures on the model of membrane stabilization of mast cells in vitro. The study was carried out on three groups of mongrel male mice, each including 5 animals. The epidermal cat’s hair allergen was used for sensitization, to dye isolated mast cells 0,1% toluidine blue solution was made use of, 5 mg/ ml sodium cromoglycate solution was used as a reference drug. Stabilizing effect of infusions and tinctures on mast cell membranes was dose-dependent. The greatest reduction in the degranulated mast cells number was noted when adding 10 mg/ml infusions or tinctures (from 19-22% to 5-10%). The decrease of the dose resulted in less marked stabilizing effect on mast cell membranes. Degranulated mast cells number statistically significantly (p<0,05) differed from that in the control. Calculated ED 50 values for the tested medicines were not significantly different for any of various forms basedon a specific raw material or for the same forms based on different raw materials. Statistically significant differences in the stabilizing effect of infusions and tinctures of Bidens species in the dose of 10 mg/ml and sodium cromoglycate solution were not detected (p<0,05). Bidens species components of infusions and tinctures didn’t possess any potential to cause anaphylactoid reactions in the studied doses. Thus Bidens species infusions and tinctures produced marked stabilizing effect on mast cell membranes in vitro. Based on the obtained data, Bidens frondosa herb may be recommended as an antiallergic agent together with Bidens tripartita herb. The choice of the form from the raw material in question is based only upon the convenience of its application.

Текст научной работы на тему «Стабилизирующее действие на мембраны тучных клеток травы череды трехраздельной и травы череды олиственной»

© КОРОЖАН Н.В., БУЗУК Г.Н., 2015

СТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА МЕМБРАНЫ ТУЧНЫХ КЛЕТОК ТРАВЫ ЧЕРЕДЫ ТРЕХРАЗДЕЛЬНОЙ И ТРАВЫ ЧЕРЕДЫ ОЛИСТВЕННОЙ

КОРОЖАН Н.В., БУЗУК Г.Н.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Республика Беларусь

Цель - изучить противоаллергическую активность настоев и настоек травы череды трехраздельной и травы череды олиственной на модели стабилизации мембран тучных клеток in vitro.

Исследование проводили на трех группах беспородных мышей-самцов, по 5 особей в каждой. Для сенсибилизации использовали аллерген эпидермальный из шерсти кошки, для окраски выделенных тучных клеток - 0,1% раствор толуидинового синего, в качестве препарата сравнения - 5 мг/мл раствор натрия кромогликата.

Стабилизирующее действие настоев и настоек травы видов череды на мембраны тучных клеток носило дозозависимый характер. Наибольшее снижение количества дегранулированных тучных клеток c 19-22% отмечалось при добавлении настоев и настоек в дозе 10 мг/мл среды (до 5-10%). Снижение дозы приводило к уменьшению выраженности стабилизирующего действия на мембраны тучных клеток. Во всех случаях количество дегранулированных тучных клеток статистически значимо (р<0,05) отличалось от такового в контроле с аллергеном для сенсибилизированной группы. При этом рассчитанные значения ЕД50 для исследуемых средств статистически значимо не различались ни для различных лекарственных форм на основе конкретного вида сырья, ни для одинаковых лекарственных форм на основе разных видов сырья. Статистически значимых отличий в стабилизирующем действии настоев и настоек травы видов череды в дозе 10 мг/мл и раствора натрия кромогликата не выявлено (р<0,05).

Компоненты настоев и настоек травы череды трехраздельной и череды олиственной не обладали способностью вызывать анафилактоидную реакцию в исследуемых дозах.

Таким образом, настои и настойки исследуемых видов череды оказывали выраженное стабилизирующее действие на мембраны тучных клеток in vitro. Исходя из полученных данных, трава череды олиственной может быть рекомендована как противоаллергическое средство наряду с травой череды трехраздельной. Выбор лекарственной формы из указанного сырья обосновывается лишь удобством ее применения.

Ключевые слова: череды трава, стабилизация мембраны тучных клеток, доза полумаксимального эффекта, натрия кромогликат.

The aim of this research was to study antiallergic activity of Bidens tripartita and Bidens frondosa herbs infusions and tinctures on the model of membrane stabilization of mast cells in vitro.

The study was carried out on three groups of mongrel male mice, each including 5 animals. The epidermal cat's hair allergen was used for sensitization, to dye isolated mast cells 0,1% toluidine blue solution was made use of, 5 mg/ ml sodium cromoglycate solution was used as a reference drug.

Stabilizing effect of infusions and tinctures on mast cell membranes was dose-dependent. The greatest reduction in the degranulated mast cells number was noted when adding 10 mg/ml infusions or tinctures (from 19-22% to 5-10%). The decrease of the dose resulted in less marked stabilizing effect on mast cell membranes. Degranulated mast cells number statistically significantly (p<0,05) differed from that in the control. Calculated ED50 values for the tested medicines were not significantly different for any of various forms based on a specific raw material or for the same forms based on different raw materials. Statistically significant differences in the stabilizing effect of infusions and tinctures of Bidens species in the dose of 10 mg/ml and sodium cromoglycate solution were not detected (p<0,05).

Bidens species components of infusions and tinctures didn't possess any potential to cause anaphylactoid reactions

in the studied doses.

Thus Bidens species infusions and tinctures produced marked stabilizing effect on mast cell membranes in vitro. Based on the obtained data, Bidens frondosa herb may be recommended as an antiallergic agent together with Bidens tripartita herb. The choice of the form from the raw material in question is based only upon the convenience of its application.

Key words: Bidens herb, stabilization of mast cell membranes, half-maximum effect dose, sodium cromoglycate.

Растения и их компоненты длительное время рассматривались как аллергены и считались этиологическими факторами ряда аллергических заболеваний. Однако последние экспериментальные и клинические данные свидетельствуют также о противоположном — противоаллергическом действии биологически активных веществ растительного происхождения [1]. Особый интерес среди них представляет растительное сырье, содержащее флавоноиды и полисахариды [2-3]. Одним из перспективных источников такого сырья являются растения рода череда. Высушенная надземная часть ряда представителей данного рода издавна применяется в народной медицине в качестве противоаллергического средства [4-6].

На территории Республики Беларусь встречается пять видов череды, из которых наиболее распространены череда трехраздель-ная и череда олиственная [7].

Изучению противоаллергической активности травы череды трехраздельной посвящен ряд работ [8-10]. Изучение данного вида активности проводилось на модели системной анафилаксии и пассивной кожной анафилаксии, также имеются данные об изучении влияния настойки и настоя на систему комплемента. Надо отметить, что зачастую полученные данные не согласуются между собой. В связи с этим изучение противоаллергической активности травы череды трехраздельной и обоснование оптимальной лекарственной формы для лечения аллергических заболеваний является актуальным.

Кроме того, практически отсутствуют данные о противоаллергической активности других видов череды. Наибольший интерес в данном случае представляет трава череды оли-ственной как растения, достаточно распространенного на территории Республики Беларусь и наиболее близкого по компонентному составу траве череды трехраздельной [11].

Целью данной работы является изучение противоаллергической активности настоев и

настоек травы череды трехраздельной и травы череды олиственной на модели стабилизации мембран тучных клеток in vitro.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись настой и настойка травы череды трехраздельной и настой и настойка травы череды олиствен-ной.

Настои из травы исследуемых видов череды получали согласно методике, изложенной в общей статье Государственной фармакопеи Республики Беларусь «Настои, отвары, чаи» [12]. Полученный настой травы череды трехраздельной содержал 0,6±0,2 мг/мл полисахаридов и 9,6±0,6 мг/мл флавоноидов, настой травы череды олиственной, соответственно, 1,6±0,5 мг/мл и 12,9±1,0 мг/мл.

Настойки получали методом мацерации. Для этого навеску сырья заливали 60% (об/ об) этиловым спиртом и настаивали в течение 5 суток. Сырье отжимали, добавляли небольшой объем 60% (об/об) этилового спирта и повторно отжимали. Вытяжки объединяли и фильтровали через бумажный фильтр, после чего доводили до требуемого исходного объема. Полученная таким образом настойка травы череды трехраздельной содержала 45,6±6,5 мг/мл флавоноидов, настойка травы череды олиственной - 43,4±5,1 мг/мл. Полисахариды в данной лекарственной форме не обнаружены.

Полученные настои и настойки упаривали. Сухой остаток растворяли в воде очищенной, объем которой рассчитывали, исходя из исследуемых доз. Выбор доз осуществляли, исходя из литературных данных о противоаллергической активности других видов череды [13].

Изучение специфической активности проводили на беспородных мышах-самцах массой 18-22 г, полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область, Всеволожский район). Животные содержались в виварии ВГМУ в соответствии с установлен-

ными требованиями [14-15]. В работе соблюдены требования гуманного обращения с экспериментальными животными [15]. Постановка экспериментального исследования с использованием лабораторных животных соответствовала общепринятым рекомендациям [16-18].

Изучение противоаллергической активности проводили на модели стабилизации мембран тучных клеток in vitro. Опытных животных делили на три группы: интактная, «плацебо» и исследуемая, по 5 особей в каждой. Интактная группа в течение 14 дней не подвергалась никаким манипуляциям. Исследуемую группу сенсибилизировали аллергеном эпидермальным из шерсти кошки («Биомед имени И.И. Мечникова», Россия) по рекомендуемой схеме [19]. Аллерген был любезно предоставлен кафедрой клинической иммунологии и аллергологии УО «ВГМУ». Аллерген 500 PNU/мл в объеме 0,1 мл (2300-2800 PNU/ кг веса животного) вводили внутрибрюшинно 2 раза с интервалом в один день. Через день после последней инъекции животным вводили аллерген в дозе 1000 PNU/мл в объеме 0,1 мл (4500-5500 PNU/кг). Выполняли две инъекции с интервалом в один день. Группе «плацебо» по аналогичной схеме вводили забуференный физиологический раствор с рН=7,4, полученный согласно рекомендациям Государственной фармакопеи Республики Беларусь [20].

Со дня последней инъекции отсчитывали семь дней и осуществляли дислокацию шейных позвонков животных исследуемой групп и группы «плацебо». Для интактной группы

данную операцию проводили спустя семь дней от момента введения животных данной группы в эксперимент. Затем животным в брюшную полость вводили 10 мл подогретого до 37°С фосфатного забуференного физиологического раствора с рН=7,4 и в течение 1-2 минут массировали брюшную стенку мыши, после чего иглой со шприцем забирали промывную жидкость из брюшной полости, переносили в пробирку с гепарином (20 ед/мл), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливали, осадок клеток смешивали с забуференным физиологическим раствором с рН=7,4, получая суспензию, содержащую 1,0*105 клеток/мл. Из полученной от каждого животного суспензии тучных клеток формировали контрольные и исследуемые пробы. К контрольным пробам добавляли забуференный физиологический раствор с рН=7,4 или аллерген в дозе 100 PNU/мл в объеме 0,1 мл. К исследуемым пробам добавляли растворенные сухие остатки настоев или настоек в дозах 10, 5 и 2,5 мг/мл среды и аллерген в дозе 100 PNU/мл в объеме 0,1 мл. Пробирки инкубировали в термостате при 37°С в течение 15 мин. В результате получали пробы для анализа, состав которых представлен в таблице 1.

К указанным пробам добавляли 0,1% раствор толуидинового синего и пробы дополнительно инкубировали в термостате при 37°С в течение 20 мин. Указанный краситель является специфичным и окрашивает в синий цвет только тучные клетки. Возможные в пробе макрофаги и лимфоциты, более крупные, чем

Таблица 1 - Состав проб для изучения стабилизации мембран тучных клеток

Группа (n животных=5)

Интактная группа Группа «плацебо» Исследуемая группа

Реактивы Контроль (физ. р-р) Контроль (аллерген) Исследуемые пробы Контроль (физ. р-р) Контроль (аллерген) Исследуемые пробы Контроль (физ. р-р) Контроль (аллерген) Исследуемые пробы

гический раствор, 0,4 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,4 0,3 0,2

Аллерген 100 PNU/ 0 0,1 0 0 0,1 0 0 0,1 0,1

настойка вида 0 0 0,1 0 0 0,1 0 0 0,1

тучные клетки, окрашиваются толуидиновым синим в красно-фиолетовый цвет. Эритроциты, которые иногда присутствуют в исследуемых пробах, в данном случае не окрашиваются и выглядят как округлые клетки, которые в 5-7 раз меньше, чем тучные клетки.

В 20 мкл полученной пробы производили подсчет 100 тучных клеток, среди которых определяли количество дегранулированных тучных клеток. Для каждой пробы подсчет проводили в двух повторностях.

В качестве препарата сравнения использовали 5 мг/мл раствор натрия кромогликата как вещества, наиболее близкого по структуре к веществам травы видов череды - флавонои-дам [21].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы «Statistica Advanced 10.0». Для сравнения результатов использовали непараметрические критерии Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни.

Как известно, количество дегранулиро-ванных тучных клеток является показателем состояния сенсибилизации организма к данному аллергену или наличия анафилактоидной реакции организма [22].

На первом этапе исследования изучали количество дегранулированных тучных клеток в интактной группе, а также в группе «плацебо». При этом контроль с физиологическим раствором в интактной группе позволял оценить базисный уровень дегрануляции, характерный для организма животных в норме. Контроль с физиологическим раствором в группе «плацебо» отражал влияние факторов стресса на состояние тучных клеток. Контроль с аллергеном в указанных группах проводился для подтверждения отсутствия сенсибилиза-

ции организма животных к используемому аллергену. Кроме того, изучалось влияние настоев и настоек травы видов череды на состояние тучных клеток с целью выявления возможной анафилактоидной реакции на компоненты лекарственных форм. Полученные результаты приведены в таблице 2. Внешний вид тучных клеток для указанных групп, а также для исследуемой группы приведен на рисунке 1.

При воздействии аллергена на тучные клетки, выделенные из животных сенсибилизированной группы, отмечалась неравномерная окраска тучных клеток, значительное увеличение их в размере, а иногда - и повреждение (разрыв) мембраны (рис. 1, В).

Стабилизирующее действие на тучные клетки настоев травы череды трехраздельной и травы череды олиственной при добавлении их к клеткам сенсибилизированной группы в присутствии аллергена носило дозозависимый характер, что представлено на рисунках 2 и 3. При этом отмечалось сохранение целостности мембран тучных клеток, а также уменьшение клеток, характеризующихся другими признаками дегрануляции (рис. 1, Д, Е).

Стабилизирующее действие на мембраны тучных клеток настоек травы череды трех-раздельной и травы череды олиственной (рис. 1, Ж, З) также носило дозозависимый характер, что представлено на рисунках 4 и 5.

Окрашивание тучных клеток в присутствии настоек в зеленый цвет обусловлено взаимодействием флавоноидов настоек с красителем.

Добавление раствора натрия кромоглика-та уменьшает дегрануляцию тучных клеток под действием аллергена до 3-5% (р<0,05) (рис. 1, Д).

Нами было установлено, что в случае контроля с физиологическим раствором в ин-

Таблица 2 - Процент дегрануляции тучных клеток в интактной группе и группе «плацебо»

Группа Контроль (физ. р-р) Контроль (аллерген) Настой, 10 мг/мл Настойка, 10 мг/мл

травы ЧТ травы ЧО травы ЧТ травы ЧО

Интактная 6,8±1,6 14,2±1,8* 8,2±1,4 5,4±2,1 7,8±2,5 8,2±1,0

«Плацебо» 7,8±1,8 14,8±1,6* 8,6±1,1 6,0±1,5* 6,4±1,4 7,0±1,5

Примечание: * - статистически значимые отличия (р<0,05) относительно контроля (физ. р-р) в каждой группе; ЧТ - череда трехраздельная, ЧО - череда олиственная.

Рисунок 1 - Внешний вид тучных клеток в исследуемых пробах: А - контроль (физ. р-р) интактной группы; Б - контроль (физ. р-р) группы «плацебо»; В - контроль (аллерген) исследуемой группы; Г - исследуемая группа - препарат сравнения; Д - исследуемая группа - настой травы череды трехраздельной 10 мг/мл; Е - исследуемая группа - настой травы череды олиственной10 мг/мл; Ж - исследуемая группа - настойка травы череды трехраздельной 10 мг/мл; З - исследуемая группа - настойка травы череды олиствененой 10 мг/мл.

до за настоя травы череды трехраздельной, мг/мл

Рисунок 2 - Дозозависимый эффект настоя травы череды трехраздельной на стабилизацию тучных клеток.

Рисунок 3 - Дозозависимый эффект настоя травы череды олиственной на стабилизацию тучных клеток.